Thạc Sĩ Nghiên cứu chuyển nạp GEN vào cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp AGROBACTERIUM TUMEFACIENS kết hợp

LỜI MỞ ĐẦU


Cây cẩm chướng du nhập vào Việt Nam từ thập niên 60, chủ yếu được trồng làm cây cảnh, trang trí. Về sau, đến những năm 80, các giống cây cẩm chướng từ các nước Pháp, Hà Lan, Trung Quốc du nhập vào nước ta. Hiện nay, cây hoa cẩm chướng không chỉ được trồng để trang trí mà được sản xuất để phục vụ mục đích kinh tế, sản xuất hoa cắt cành. Tuy nhiên, hoa do chúng ta xuất khẩu chưa thể cạnh tranh được với các nước lớn do chất lượng và màu sắc hoa không phong phú bằng. Để hướng tới mục đích kinh tế, cần cải thiện và nâng cao chất lượng giống hoa cẩm chướng. Phương pháp khoa học ta có thể áp dụng là phục tráng, lai tạo và chuyển các gen mang đặc tính tốt cho cây.

Một trong những yếu tố làm giảm chất lượng hoa là sự lão suy cành hoa sau khi cắt. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã khám phá ra sự lão suy cây có thể khắc phục nhờ hợp chất cytokinin. Tuy nhiên xử lý ctytokinin từ bên ngoài có thể làm chậm sự lão suy lá trong một số loại cây một lá mầm và hai lá mầm, chiến lược chuyển gen sản xuất cytokinin tự điều chỉnh này được kỳ vọng có tiềm năng trong việc làm chậm quá trình lão suy ở một phổ rộng các loại cây trồng. Đề tài “Nghiên cứu chuyển gen vào cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp Agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm” với gen chuyển mục tiêu là gen ipt (isopentenyl transferase) tổng hợp cytokinin hướng hẹn sẽ cải thiện và nâng cao chất lượng giống cây hoa cẩm chướng.

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Công nghệ gen thực vật 1
1.1.1. Các phương pháp chuyển gen thực vật 1
1.1.1.1. Phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng sóng siêu âm 1
1.1.1.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium 3
1.1.1.3. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm. 9
1.1.2. Đoạn gen cần tách dòng, gen chỉ thị, gen chọn lọc .12
1.1.2.1. Đoạn gen cần tách dòng và gen ipt (isopentenyl transferase) 12
1.1.2.2. Gen chỉ thị, gen chọn lọc 14
1.1.3. Các phương pháp phân tích cây chuyển gen 16
1.1.3.1. Phương pháp thử khả năng kháng hygromycin, kanamycin, PPT (phosphinothiricin) của cây tái sinh 16
1.1.3.2. Phương pháp thử GUS 16
1.1.3.3. Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 17
1.1.3.4. Phương pháp phân tích điện di 18
1.1.3.5. Phương pháp Southern blot. 19
1.2. Giới thiệu về cây hoa cẩm chướng 21
1.2.1. Khái quát về cây cẩm chướng 21
1.2.2. Đặc điểm hình thái và sự sinh trưởng Phát triển của cây cẩm chướng 26
1.2.3. Điều kiện ngoại cảnh 27
1.2.4. Nhân giống cây cẩm chướng 29
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu 33
2.1.1. Cẩm chướng 33
2.1.2. Chủng vi khuẩn A.tumefaciens có chứa plasmid pVDH396 tái tổ hợp 34
2.1.3. Môi trường và hóa chất sử dụng 35
2.1.4. Điều kiện thí nghiệm 36
2.2. Sơ đồ qui trình và nội dung nghiên cứu 37
2.3. Phương pháp nghiên cứu 38
2.3.1. Phương pháp khử trùng hạt cẩm chướng 38
2.3.2. Phương pháp khảo sát môi trường tái sinh cây cẩm chướng từ lá 40
2.3.3. Phương pháp khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycine 40
2.3.4. Phương pháp chuyển gen ipt gián tiếp nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciences kết hợp sóng siêu âm. 41
2.3.5. Phương pháp nhuộm GUS. 42
2.3.6. Phương pháp tách chiết DNA thực vật. 44
2.3.7. Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction). 45
2.3.8. Phương pháp chạy điện di. 46



CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát nồng độ javel và thời gian khử trùng hạt giống 48
3.2. Kết quả khảo sát môi trường tái sinh cây cẩm chướng từ lá 52
3.3. Kết quả khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycin 57
3.4. Kết quả chọn lọc mô cẩm chướng mang gen chuyển 61
3.5. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện tạm thời của gen chuyển 64
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận 66
4.2. Đề nghị 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC