Tiến Sĩ Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccin

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NĂM 2013

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu nghiên cứu . 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
4. Những đóng góp mới của luận án 3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn . 4
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 5
1.1. BỆNH CÚM GIA CẦM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1 . 5
1.1.1. Bệnh cúm gia cầm và dịch bệnh cúm A/H5N1 . 5
1.1.2. Virus cúm A/H5N1 6
1.2. VACCINE PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM A/H5N1 19
1.2.1. Các loại vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 . 19
1.2.2. Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 . 22
1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT 27
1.3.1. Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương 27
1.3.2. Thành tựu ứng dụng kỹ thu ật chuy ển gen trong chọn giống đậu tương . 39
1.3.3. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu sản xuất vaccine thực vật 44

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49
2.1. VẬT LIỆU . 49
2.1.1. Nguyên liệu thực vật 49
2.1.2. Chủng vi khuẩn và các loại vector 49
2.1.3. Hóa chất . 49
2.1.4. Thiết bị 49
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50
2.2.1. Nhóm phương pháp sử dụng để thiết k ế vector chuyển gen 51
2.2.2. Các phương pháp sử dụng trong xây dựng mô hình tái sinh và chuyển gen in vitro . 57
2.2.3. Phương pháp phân tích cây chuyển gen 62
2.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THÀNH LUẬN ÁN 63

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . 64
3.1. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN HA VÀ ĐOẠN GEN HA1 CỦA VIRUS H5N1 . 64
3.1.1. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang gen HA 64
3.1.2. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen HA1 . 79
3.2. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN MANG ĐOẠN GEN HA1 87
3.2.1. Phát triển hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở hai giống đậu tương
ĐT12 và DT84 . 87
3.2.2. Kết quả chuyển gen gus vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn 95
3.2.3. Kết quả chuyển cấu trúc đoạn gen HA1 vào cây đậu tương 100
3.3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN MANG ĐOẠN GEN HA1 . 102
3.3.1. Phân tích sự có mặt của đoạn gen HA1 ở các dòng cây đậu tương
chuyển gen ở thế hệ T0 . 102
3.3.2. Phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 . 104
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 108


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao và hằng năm trên thế giới đã có hơn nửa tỷ người mắc bệnh. Hiện nay, virus cúm A/H5N1- chủng virus nguy hiểm nhất ở gia cầm đã lan truyền trên 40 quốc gia ở châu Á, Trung đông, châu Âu và châu Phi. Ở nước ta, dịch cúm gia cầm H5N1 xảy ra từ những tháng cuối năm 2003 gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cầm và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. Việt Nam và Indonesia là hai quốc gia có số người nhiễm virus cúm A/H5N1 và có tỷ lệ tử vong cao nhất so với các quốc gia trên thế giới. Chính vì vậy nghiên cứu làm sáng tỏ bệnh cúm A/H5N1 và nhân tố gây bệnh để xây dựng biện pháp phòng và
khống chế bệnh là yêu cầu thực tiễn đặt ra.
Dịch cúm gia cầm diễn biến ngày càng phức tạp vì hệ gen của virus cúm A luôn biến đổi. Bên cạnh đó, nguồn tàng trữ và lây lan bệnh là chim di cư và thủy cầm rất khó kiểm soát và khống chế. Hiện nay, việc phòng chống virus cúm A nói chung và H5N1 nói riêng, bên cạnh các biện pháp phòng chống dịch như tiêu độc, xử lý gia cầm bị bệnh, thanh lý gia cầm nhiễm hoặc nguy cơ nhiễm thì biện pháp sử dụng vaccine vẫn là hướng thiết yếu nhất để khống chế và ngăn chặn sự lây lan dịch sang người. Hiện nay, ngoài vaccine truyền thống, vaccine thế hệ mới được tạo ra bằng các phương pháp tái tổ hợp và di truyền ngược đang được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, các loại vaccine này có nhược điểm như giá thành cao, khó bảo quản và mức độ an toàn thấp. Do vậy, các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát triển những loại vaccine mới có tính ưu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản, an toàn và hiệu quả hơn. Vaccine ăn được từ thực vật là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine thực vật có hoạt tính tương tự như vaccine thông thường, chỉ khác là vaccine này được thực vật sản xuất trong những phần ăn được như lá, củ, quả và hạt. Vaccine thực vật có
một số ưu điểm nổi bật so với các loại vaccine khác ở chỗ có thể ăn tươi hoặc nấu chín; dễ dàng sản xuất khối lượng lớn bằng cách tăng diện tích trồng cây chuyển gen có khả năng sản xuất kháng nguyên; vaccine thực vật có tính ổn định, an toàn cao, dễ bảo quản, dễ sử dụng và có hiệu quả kinh tế.
Ở Việt Nam, đậu tương là cây có giá trị kinh tế cao, hạt đậu tương là nguồn thực phẩm chính cho vật nuôi và con người. Sự biểu hiện thành công gen gus trên cây đậu tương là cơ sở của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen đểsản xuất các chất có dược tính như vaccine trong hạt đậu tương. Với ưu điểm nổi bật như sản xuất đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh và có độ an toàn, vaccine sản xuất từ thực vật được xem là hướng đi phù hợp trong chiến lược chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ở các quốc gia đang phát triển.
Xuất phát từ lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án là: “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Thiết kế được vector mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus cúm A/H5N1.
Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc đoạn gen HA1 và biểu hiện được protein tái tổ hợp HA1 ở hạt đậu tương.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Thiết kế và tổng hợp gen HA và đoạn gen HA1, nhân dòng gen HA và đoạn gen HA1 trong tế bào vi khuẩn E.coli và tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1.

3.2. Biến nạp cấu trúc vector chuyển gen mang gen HA và đoạn gen HA1 vào vi khuẩn A. tumefaciens. Lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô lá thuốc lá và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen HA và đoạn gen HA1;
3.3. Phát triển hệ th ống tái sinh đa chồi ph ục vụ chuy ển gen ở cây đậu tương;
3.4. Chuyển cấu trúc vector mang gen gus biểu hiện ở hạt vào cây đậu tương. Đánh giá hiệu quả chuyển gen gus ở giống đậu tương ĐT12 và DT84;
3.5. Chuyển cấu trúc vector mang đoạn gen HA1 vào cây đậu tương và phân tích sự có mặt của đoạn gen chuyển HA1 ở cây đậu tương của thế hệ T0;
3.6. Phân tích dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 bằng kỹ thu ật PCR và lai Western blot để xác đị nh sự biểu hiện của protein HA1 ở hạt đ ậu tương.
4. Những đóng góp mới của luận án4.1. Hai cấu trúc vector mang gen HA và mang đoạn gen HA1 biểu hiện trong hạt đã được thiết kế thành công và tạo được chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus cúm A/H5N1.
4.2. Giống đậu tương ĐT12 và DT84 đã được thử nghiệm chuyển gen gus. Hiệu suất chuyển gen được kiểm tra ở giai đoạn hạt là 7,8% đối với giống ĐT12 và 4,3 % với giống DT84.
4.3. Chuyển cấu trúc SLHEP-HA1 vào cây đậu tương và thu được 8 dòng cây đậu tương ở thế hệ T0 mang cấu trúc vector biểu hiện đặc trưng trong hạt SLHEP-HA1.
4.4. Ở thế hệ T1 đã thu được dòng đậu tương H11 chuyển gen mang đoạn gen HA1 và biểu hiện thành công protein HA1 trong hạt của dòng đậu tương H11.

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Về khoa học: Đã thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và
đoạn gen HA1 biểu hiện ở hạt thực vật. Biểu hiện thành công gen gus ở hạt.
Đã hoàn thiện được quy trình tái sinh đa chồi ở cây đậu tương. Với việc lây
nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu tương đã tổn thương,
tạo cây đậu tương chuyển gen và đã biểu hiện thành công protein HA1 của
virus H5N1 trong hạt đậu tương.
Về thực tiễn: Với kết quả protein HA1 đã được biểu hiện thành công trong hạt
đậu tương ở thế hệ T1
là cơ sở của việc tiếp tục kiểm tra đáp ứng khả năng
miễn dịch của gia cầm, đồng thời làm tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất
vaccine ăn được ở thực vật.