Thạc Sĩ Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào lan dendrobium cv. Burana white bằng vi khuẩn agrobact

MỞ ĐẦU

Họ Phong Lan là một họ lớn của thực vật có hoa, gồm hơn 800 giống và 30.000 loài, đặc biệt là hoa rất đẹp. Có rất nhiều loài Phong Lan đã được thương mại hóa trên thế giới, trong số đó có Dendrobium. Dendrobium là một trong những giống lan thương mại quan trọng được trồng phổ biến dùng như hoa cắt cành lẫn cây trồng chậu bởi hoa đẹp, dễ trồng và thích ứng với phổ khí hậu rộng. Việc áp dụng các kỹ thuật di truyền vào thực vật mở ra cơ hội có thể đưa các tính trạng mới mong muốn vào Phong Lan. Kết quả đã tạo ra rất nhiều giống lan mới không chỉ có giá trị kinh tế mà còn góp phần làm tăng thêm tính đa dạng cho Phong lan. Tuy có nhiều phương pháp chuyển gen khác nhau vào thực vật, nhưng hai phương pháp chuyển gen thường được sử dụng nhiều nhất, đó là phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen và phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium. Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm khác nhau, nhưng việc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium làm công cụ chuyển gen sẽ giúp gen mục tiêu gắn chèn vào bộ gen thực vật chủ bền vững hơn. Tuy nhiên, việc chuyển bất cứ gen ngoại lai nào vào bất cứ đối tượng nào không phải lúc nào cũng thành công tốt đẹp. Điều này còn tùy vào đặc tính của từng họ, từng loài, từng loại mô, loại kháng sinh sử dụng để diệt khuẩn . Do đó, việc chuyển gen ngoại lai vào đối tượng thực vật, đặc biệt là Phong Lan, thì điều trước hết cần phải thực hiện là xây dựng quy trình chuyển gen ổn định, đồng thời tối ưu một số nhân tố khác để nâng cao hiệu suất chuyển gen. Hiện nay, có rất nhiều gen thường được sử dụng trong chuyển gen, chẳng hạn như gen phát sáng xanh lá cây gfp (từ sứa Aequorea victoria), gen phát sáng đỏ Ds-Red (từ bọt biển Discosoma sp.), gen luc (từ đom đóm Photinus pyralis) . trong số đó có cả gen kháng thuốc diệt cỏ (gen bar). Và đã có rất nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới sử dụng gen bar như là gen mục tiêu trên một số đối tượng như Saccharum sp. (Manickavasagam và cộng sự, 2004), Pinus radiata (Charity J.A. và cộng sự, 2005), Zea mays (Vega J., 2008) . Tuy nhiên, công trình áp dụng chuyển nạp gen bar cho đối tượng Phong Lan là rất ít, và chỉ thấy có một bài báo đã sử dụng gen bar làm gen mục tiêu để khảo sát trên ba giống Lan (Brassia, Cattleya, và Doritaenopsis) (Knapp J.E., Kausch A.P. và Chandlee J.M., 2000). Kết quả cho thấy gen bar này biểu hiện rất tốt và có thể sử dụng vừa như gen mục tiêu vừa như gen chọn lọc. Trên cơ sở phân tích đó, luận văn sẽ tập trung chủ yếu vào việc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển gen bar vào Phong lan Dendrobium CV. BURANA WHITE, nhằm bước đầu xây dựng quy trình chuyển nạp gen bar, để từ đó góp phần tìm hiểu thêm gen này sẽ biểu hiện như thế nào trên giống lan Dendrobium CV. BURANA WHITE cũng như có thể áp dụng chuyển gen trên các giống lan khác, và đồng thời làm tiền đề cho việc chuyển nạp gen khác có giá trị thương mại vào Phong lan nói chung và Dendrobium nói riêng.


MỤC LỤC


Trang phụ bìa
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC BIỂU ĐỒ

MỞ ĐẦU . 1
1. TỔNG QUAN . 3
1.1 Sơ lược về họ Lan 3
1.2 Sơ lược về Phong Lan Dendrobium 3
1.2.1 Vị trí phân loại 3
1.2.2 Nguồn gốc và sự phân bố 4
1.2.3 Đặc điểm hình thái Dendrobium 4
1.3 Các phương pháp nhân giống . 6
1.3.1 Phương pháp tách chiết . 6
1.3.2 Phương pháp gieo hạt 6
1.3.3 Phương pháp lai tạo . 7
1.3.4 Phương pháp nuôi cấy mô . 7
1.3.5 Phương pháp cắt lát mỏng (Thin Cross Section) 7
1.3.6 Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng . 7
1.4 PLB (Protocorm-Like Body) 8
1.4.1 Thuật ngữ 8
1.4.2 Các nguồn nguyên liệu tạo PLB 8
1.5 Cách trồng và chăm sóc lan Dendrobium . 8
1.5.1 Điều kiện sống của Dendrobium . 8
1.5.2 Cách trồng lan Dendrobium 10
1.5.3 Cách chăm sóc lan Dendrobium 10
1.6 Giá trị của Phong Lan . 11
1.6.1 Giá trị dược liệu 11
1.6.2 Giá trị kinh tế 12
1.7 Tình hình sản xuất hoa lan ở nước ta và trên thế giới 12
1.8 Các phương pháp chuyển gen . 14
1.8.1 Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens 14
1.8.2 Một số phương pháp chuyển gen khác vào thực vật 22
1.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển nạp gen . 25
1.9.1 Xử lý mẫu . 25
1.9.2 Thời gian đồng nuôi cấy và mật độ A. tumefaciens 25
1.9.3 Làm khô mẫu cấy 26
1.9.4 Xử lý với chất chống hoại tử . 26
1.9.5 Nhiệt độ 27
1.9.6 Chất hoạt động bề mặt . 27
1.9.7 Môi trường ủ và môi trường đồng nuôi cấy . 27
1.9.8 Kháng sinh 28
1.9.9 Marker chọn lọc 30
1.10 Ứng dụng plasmid Ti trong công nghệ chuyển gen ở thực vật 30
1.11 So sánh phương pháp bắn gen với phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens 32
1.12 Cấu trúc của gen chuyển nạp 32
1.12.1 Promoter và terminator 32
1.12.2 Gen chọn lọc (selectable gene) 33
1.12.3 Gen chỉ thị (reporter gene) . 34
1.13 Một số phương pháp phát hiện gen chuyển . 35
1.13.1 Phương pháp thử GUS 35
1.13.2 Phương pháp thử khả năng kháng kháng sinh hay thuốc diệt cỏ (PPT) của cây tái sinh trong in vitro . 35
1.13.3 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 35
1.14 Tình hình nghiên cứu thực vật chuyển gen . 37
1.14.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gen lan Dendrobium trên thế giới 37
1.14.2 Tình hình nghiên cứu chuyển gen thực vật ở Việt Nam . 39
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 41
2.1 Vật liệu thí nghiệm . 41
2.1.1 Đối tượng thí nghiệm 41
2.1.2 Môi trường nuôi cấy 41
2.1.3 Chủng vi khuẩn A. tumefaciens . 41
2.1.4 Thiết bị và hóa chất thực hiện chuyển nạp gen bằng A. tumefaciens 42
2.2 Phương pháp thực hiện . 44
2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của PPT đến khả năng sống của PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE . 45
2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh cefotaxim và meropenem lên khả năng sống của PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE và sự tái nhiễm khuẩn qua đồng nuôi cấy 45
2.2.3 Thử nghiệm quy trình biến nạp gen vào lan Dendrobium CV. BURANA WHITE bằng vi khuẩn A. tumefaciens . 46
2.2.4 Tái sinh các mẫu PLB giả định chuyển gen bằng A. tumefaciens trên môi trường chọn lọc có bổ sung PPT . 48
2.2.5 Kiểm tra sự hiện diện của gen bar trong PLB tái sinh trên môi trường chọn lọc bằng kỹ thuật PCR . 49
2.2.6 Khảo sát khả năng kháng chịu với PPT của PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE chuyển gen 53
3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 54
3.1 Khảo sát ảnh hưởng của PPT đến khả năng sống của PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE . 54