Thạc Sĩ Nghiên cứu chuyển gen kháng nguyên Ha1 của virus H5N1 vào bèo tấm Wolffia globosa nguyên cây thông q

Luận văn thạc sĩ
Đề tài: Nghiên cứu chuyển gen kháng nguyên Ha1 của virus H5N1 vào bèo tấm Wolffia globosa nguyên cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Mô tả bị lỗi font vài chữ, file tài liệu thì bình thường

MỤC LỤC
Lời cam ñoan 1
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các chữviết tắt v
Danh mục bảng vi
Danh mục hình vii
1 MỞ ðẦU 1
1.1 ðặt vấn ñề 1
1.2 Mục ñích và yêu cầu của ñềtài 2
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Giới thiệu chung vềbèo tấm Wolffia globosa 3
2.2 Cơsởkhoa học của chuyển gen ởthực vật 5
2.3 Cơsởkhoa học của phương pháp PCR 15
2.4 Tình hình nghiên cứu trên thếgiới 16
3 ðỐI T ƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PH ƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
3.1 Vật liệu 22
3.2 Nội dung nghiên cứu 23
3.3 Phương pháp nghiên cứu 24
3.4 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 35
4 KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN 36
4.1 Nghiên cứu tối ưu hoá một số y ếu tố ảnh hưởng ñến quá trình
biến nạp gen vào bèo tấm Wolffia globosa 36
4.1.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào bèo
tấm Wolffia globosanguyên cây 36
4.1.2 Xác ñịnh mật ñộvi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen vào bèo
tấm Wolffia globosa 38
4.1.3 Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm ñến tỷlệbiểu hiện của
gen gus ởbèo Wolffia globosachuyển gen 41
4.1.4 Xác ñịnh thời gian lây nhiễm thích hợp của vi khuẩn
A.tumefaciensvới bèo tấm Wolffia globosa 43
4.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) ñến
tỷlệbiểu hiện của gen gus ởbèo Wolffia globosachuyển gen 45
4.1.6 Xác ñịnh môi trường ñồng nuôi cấy bèo tấm – vi khuẩn thích hợp. 47
4.1.7 ðánh giá ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷlệbiểu
hiện của gen gus ởbèo Wolffia globosachuyển gen 48
4.2 Nghiên cứu xác ñịnh nồng ñộ chất kháng sinh (Cefotaxim ,
Timentin) thích hợp ñểloại bỏvi khuẩn A. tumefacienssau biến nạp 50
4.3 Nghiên cứu xác ñịnh ngưỡng gây chết của kháng sinh thực vật
ñến bèo tấm W.globosa 51
4.4 Phân tích PCR cây chuyển gen 57
5 KẾT LUẬN VÀ ðỀNGHỊ 59
5.1 Kết luận 59
5.2 ðềnghị 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO 61
PHỤLỤC 66


1. MỞ ðẦU
1.1. ðặt vấn ñề
Cùng với sựphát triển của khoa học kỹ thuật, ñời sống con người cũng
không ngừng ñược nâng cao. Việc chăm sóc sức khỏe cộng ñồng ngày càng
ñược quan tâm chú ý hơn. Nhất là trong giai ñoạn hiện nay, khi mà hiện tượng
kháng thuốc ñối với các tác nhân gây bệnh cũkhá phổbiến và sốlượng các tác
nhân gây bệnh mới xuất hiện ngày càng nhiều thì việc chăm sóc sức khỏe con
người ñã trở thành m ột vấn ñề bức thiết của toàn xã hội. Các phương pháp
phòng bệnh luôn ñược ưu tiên hàng ñầu ởmọi quốc gia. Tuy nhiên, do giá thành
vaccine sản xuất còn rất cao và lượng vaccine sản xuất còn hạn chếnên nhiều
nước ñang phát triển vẫn không thểcung cấp ñầy ñủvaccine ñểphòng ngừa các
loại bệnh nguy hiểm. Ngoài ra, việc bảo quản và sửdụng các loại vaccine sống
nhược ñộc cũng phải tuân thủnhững quy tắc rất nghiêm ngặt nếu không sẽmất
tác dụng, thậm chí có thểquay trởlại dạng ñộc gây nguy hiểm cho người sử
dụng. Vì vậy, một yêu cầu ñặt ra cho các nhà khoa học trên thếgiới là phải tìm
ra phương pháp sản xuất vaccine m ới có hiệu quảcao và giá thành hạ.
Hiện nay, một hướng nghiên cứu mới ñang thu hút sựquan tâm của các
nhà khoa học trên thếgiới, ñó chính là ứng dụng công nghệsinh học trong sản
xuất vaccine thực vật, hay còn gọi là “Vaccine thực phẩm”. ðây chính là các
protein tái tổhợp do thực vật tạo ra sau khi ñược chuyển gen. So với phương
pháp sản xuất vaccine truy ền thống, hệthống thực vật có nhiều lợi thếhơn
hẳn. Vaccine thực phẩm an toàn hơn hẳn so với các loại vaccine nhược ñộc
hiện nay do chúng không có khảnăng quay trởlại dạng ñộc ñểgây nguy hiểm
cho người sửdụng. Vềmặt giá thành, thực vật có thểtrồng trên diện tích rộng
với chi phí thấp hơn rất nhiều so với việc nuôi cấy tếbào ñộng vật ñểsản xuất
các loại vaccine nhược ñộc. Ngoài ra, việc bảo quản và sửdụng vaccine cũng
ñươn giản hơn nhiều. Thay vì việc tiêm chủng thường gây chi phí tốn kém,
người sửdụng chỉcần ăn các loại rau quảmang vaccine thực phẩm.
Nhiều loài cây trồng ñã ñược các nhà khoa học chọn làm ñối tượng ñể
nghiên cứu cho mục tiêu trên và thu ñược những thành công ñáng kể. Trong
số các loài thực vật ñược nghiên cứu ñể sử dụng làm hệ thống sản xuất
protein tái tổhợp, các loài thuộc họBèo tấm (Lemnaceae) ñang ñược ñặc biệt
chú ý bởi chúng có rất nhiều ưu ñiểm.
Bèo tấm Wolffia globosalà một thực vật nhỏbé nhưng lại có sức sống
mạnh mẽ. Chúng có thểsống ởnhiều vùng khí hậu khác nhau; có khảnhân
sinh khối nhanh; chứa nhiều loại vitamin A, B1, B2, và ñặc biệt là chúng có
bộmáy sản xuất protein khá mạnh. Với những ưu ñiểm ñó bèo tấm Wolffia
globosamang nhiều lợi thếcho việc sản xuất các loại protein tái tổhợp.
Xuất phát từnhững lý do trên chúng tôi ñã thực hiện ñềtài: “Nghiên
cứu chuyển gen kháng nguyên Ha1 của virus H5N1 vào bèo tấm Wolffia
globosa nguyên cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”.
1.2. Mục ñích và yêu cầu của ñềtài
1.2.1. Mục ñích
- Xây dựng thành công quy trình chuyển gen kháng nguyên Ha1cảu
virus vào bèo tấm W. globosa nguyên cây thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
- Tạo ñược mẫu bèo tấm Wolffia globosamang gen Ha1.
1.2.2. Yêu cầu
- Tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưỏng ñến quá trình biến nạp gen, bao
gồm: Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciensthích hợp cho biến nạp gen,
mật ñộvi khuẩn thích hợp ñểbiến nạp, thời gian biến nạp,
- Sửdụng các loại kháng sinh như: Geneticin, Paromomycin ñểchọn
lọc cánh bèo chuyển gen và nhân dòng.
- Kiểm tra sựcó mặt của gen Ha1trong hệgen của bèo tấm Wolffia
globosabằng phản ứng PCR.

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung vềbèo tấm Wolffia globosa
2.1.1. Nguồn gốc và vịtrí phân bố
Wolffia globosa ñược tìm thấy ởcác vùng thung lũng có khí hậu nóng
thuộc trung tâm và miền nam California, ởvùng bùn lầy của các kênh mương
dọc miền tây Nevada, và cảnhững cánh ñồng lúa ởtrung tâm Valley. Ngoài
California người ta còn tìm thấy Wolffia globosa ởnhững vùng khác của Mỹ
nhưmiền nam Florida. Wolffia globosacòn phân bốrộng khắp các vùng nhiệt
ñới nóng ẩm trên thế giới như Châu Phi, Ấn ðộ, ðông Nam Á, ðảo
Hawai, . [22], [23].
2.1.2. Phân loại thực vật
Họ Bèo tấm (Lemnaceae) có 5 chi: Spirodela, Landoltia, Lemna,
Wolffia, Wolffiella và ñược chia làm 38 loài. Trong họ Lemnaceae, chi
Spirodela ñược xem là nguyên thủy nhất với 2 loài là Spirodela polyrhizavà
Spirodela intermedia. Nó ñược xếp ñầu tiên trong cây phân loại. Trái lại, chi
Wolffia ñược coi là chi tiến hóa nhất do có ít ñặc ñiểm giống với Spirodela
nhất, nằm ởvịtrí cao nhất trong cây phân loại. Xét vềhình thái thì Spirodela,
Landoltia, Lemnacó quan hệgần gũi với nhau. Ba chi này có rất nhiều ñặc
ñiểm chung, trong ñó Landoltiamang hình thái chung gian giữa Spirodelavà
Lemna[22], [23].

TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu trong nước
1. Lê Văn Chi, 1992. Cách sửdụng chất ñiều hòa sinh trưởng và vi lượng ñạt
hiệu quảcao. NXB Khoa học Kỹ thuật (trang 5-23).
2. Nguyễn Quang Thạch; Nguyễn Thị Lý Anh; Nguy ễn Thị Phương Thảo
(2005). Giáo trình công nghệsinh học nông nghiệp. NXB Nông nghiệp.
3. Phạm ThịLý Thu; Nguyễn Hải Anh; Phạm ThịHương; Nguyễn ThịHòa;
Lê Huy Hàm. “Hoàn thiện quy trình chuyển gen vào bèo tấm Wolffia
thông qua vi khuẩn Agrobacterium tunmefaciens”. Tạp chí Công nghệ
Sinh học8(1): 1-8, 2010.
4. VũVăn Tiến; ðỗNăng Vịnh; Lê Huy Hàm (2006). “Nghiên cứu xây dựng
hệ thống tái sinh học bèo tấm Lemna aequinoctialis”. Tạp chí Côgn
nghệsinh học;2006/số3.
5. VũVăn Tiến; ðỗNăng Vịnh; Lê Huy Hàm (2006). “Bước ñầu nghiên cứu
chuyển gen vào bèo tấm Lemna aequinoctialis”. Tạp chí Nông nghiệp
và phát triển nông thôn; 2006/số14; 12-15.
II. Tài liệu nước ngoài
6. Anderson W.C (1980), Culture initiation and short multiplication, Theory
and practice. In: Plant tissue culture,P: 69-72.
7. Aziz, M. A.; Singh, S.; Kumar P.A.; Bhatnagar, R. (2002) Expression of
protective antigen in transgenic plant: a step toward edible vaccine
against anthax. Biochemical and Biophysical Reseach communications
299, 345-351.
8. Boehm R; Kruse C; Voeste D; Barth S; and Schnabl H. A transient
transformation system for duckweed (Wolffia columbiana) using
Agrobacteriummediated gene transfer. J Appl Bot 2001; 75; 107-111.
9. Bouch F.B.; Marquet-Blouin E.; Yanagi Y.; Steinmetz A.; Muller C.P.;
(2003), Neutralizing immunogennicity of apolyepitope antigen
expressed in a transgenic food plant: a novel antigen to protect against
measles. Vaccine 21, P: 2074-2081.
10. Buddhavarrapu; Lakshimi R. and Hancock; Sean J. (1991), Avanced
treatment for lagoon using duckweed. Water Enviroment and
Technology.
11. Carrilo, C.; Wigdorovitz, A.; Trono, K.; Dus Santos, M.J.; Castanon, S.;
Sadir, A.M.; Ordas, R.; Escribano, J.M.; Borca, M.V. (2001) Induction
of avirus-specific antibody response to food and mouth desease virus
using the structural protein VP1 expressd in transgenic potato plant.
Viral Immunology 14, 49-57.
12. Chikwamba r.; Cunnick, J.; Hathaway, D.; McMurray,J.; Mason, H.; Wang,
K. (2002) A functional antigen in a practical crop:LT-B producing maize
protects mice against Escherichia coli heat labile enterotosin (LT) and
cholera toxin (CT). Transgenic Research11, 479-493.
13. Daubs; Edwin H.; A Monograph of Lemnaceae: Illinios Biological
Monographs. The University of Illinios Press, Urbana, 1965, 1965, P:
2-49.
14. Edelman M; Per A; Flaishman M and Blumenthal A. Transgenic
Lemnaceae. International Application Published under the Patent
Cooperration Treaty (PCT) WO/99/19498; 1998, pp 1-56.
15. International application published under the partent cooperation treaty,
International Publishcation number: WO 99/19498 (22/04/1999), P:2-3.
16. International application published under the partent cooperation treaty,
International Publishcation number: WO 99/19498 (22/04/1999), P: 5-24.