Thạc Sĩ Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen CODA vào cây cà chua

iii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1. Tổng quan về cây cà chua 3
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, giá trị của cây cà chua . 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học . 6
1.1.3. Một số nghiên cứu về chọn tạo giống cà chua trên thế giới và ở Việt Nam . 7
1.2. Gen codA mã hóa choline oxydase 12
1.2.1. Giới thiệu về gen codA 12
1.2.2. Giới thiệu về glycine betaine 13
1.2.3. Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp glycine betain tăng cường khả năng
chống chịu điều kiện môi trường bất lợi 17
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Vật liệu nghiên cứu 21
2.1.1. Vật liệu thực vật 21
2.1.2. Chủng khuẩn . 21
2.1.3. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm . 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu 22
2.2.1. Phương pháp tạo cây cà chua chuyển gen 22
2.2.2. Phương pháp phân tích và đánh giá cây chuyển gen 26
2.2.3. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu . 32
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 33
3.1. Kết quả chuyển gen, tái sinh và chọn dòng cà chua chuyển gen codA 33
3.1.1. Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc mang gen codA trong vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens 33
3.1.2. Kết quả chuyển gen, tái sinh và chọn dòng cà chua chuyển gen codA . 34
3.1.3. Phân tích cây cà chua chuyển gen codA bằng kỹ thuật PCR 37
3.1.4. Phân tích cây cà chua chuyển gen codA bằng kỹ thuật RT-PCR 38
3.2. Đánh giá khả năng chịu mặn của dòng cà chua chuyển gen trong in vitro 41
3.2.1. Chọn lọc ngưỡng chịu mặn của cà chua trong in vitro . 41
3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của cây cà chua chuyển gen . 42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .47 iv

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/


TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 v

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số loài cây trồng chuyển gen codA mã hóa enzyme tham gia sinh tổng hợp
glycine betaine, tăng khả năng chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi . 19
Bảng 2.1: Môi trường nuôi và chọn lọc cây cà chua chuyển gen . 23
Bảng 2.2: Thành phần môi trường LB đặc 23
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR nhân gen . 27
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ở ống 1 . 29
Bảng 2.6: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ở ống 2 . 30
Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR nhân gen actin từ cDNA 31
Bảng 2.8: Thành phần phản ứng PCR nhân gen codA từ cDNA 31
Bảng 3.1: Tổng hợp kết quả chuyển gen codA vào cây cà chua . 34
Bảng 3.2: Kết quả đánh giá khả năng ra rễ ở cây cà chua in vitro trong điều kiện
bổ sung NaCl vào môi trường nuôi cấy . 41
Bảng 3.3: Tổng hợp kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của cây cà chua chuyển gen 43 vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Con đường sinh tổng hợp GB ở thực vật bậc cao 15
Hình 1.2: Con đường sinh tổng hợp GB ở vi khuẩn E. coli 15
Hình 1.3: Con đường sinh tổng hợp GB ở vi khuẩn A. globiformis . 16
Hình 1.4: Sinh tổng hợp GB ở Actinopolyspora halophilia 16
Hình 2.1: Sơ đồ thí nghiệm tổng quát . 22
Hình 3.1: Sơ đồ thiết kế cấu trúc đoạn T-DNA của vector chuyển gen pBI121/codA 33
- A. tumefaciens . 33
Hình 3.3: Một số hình ảnh chuyển gen codA vào cây cà chua PT18 . 35
37
Hình 3.5: Sản phẩm PCR nhân gen codA từ DNA tổng số tách chiết từ một số dòng cà
chua chuyển gen và không chuyển gen 37
Hình 3.6: Kết quả tách chiết RNA từ mẫu cây cà chua . 38
Hình 3.7: Kết quả tách RNA khi loại DNA bằng DNAse . 39
Hình 3.8: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen actin
trong các dòngcà chua PT18 chuyển gen . 40
Hinh 3.9: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen codA
trong các dòngcà chua PT18 chuyển gen . 40
Hình 3.10: Cây cà chua không chuyển gen trên trên môi trường ra rễ ở các nồng độ
muối NaCl 42
Hình 3.11: Các dòng cà chua chuyển gen codA và không chuyển gen trên môi trường
ra rễ có bổ sung 200mM NaCl 44
Hình 3.12: Mảnh lá cà chua tái sinh trên môi trường có bổ sung 200 mM NaCl 45

vii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/


DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT


Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt
µl micro lit
µM micro mol
AS Acetosyringone Chất dẫn dụ
BAP 6-Benzyl amino purine
Bp Base pair
cDNA Complementary DNA
Sợi DNA bổ sung được tổng
hợp từ RNA thông tin nhờ
enzyme sao mã ngược
Cefo Cefotaxime
CodA Choline oxidase gene
Cs Cộng sự
DNA Deoxirionucleic Acid
GB Glycine betaine
IBA Indolyl acetic acid
Kb Kilo base
MS Murashige and Skoog, 1962 Môi trường cơ bản
M Marker Thang Marker chuẩn
mM Milimol
NAA Naphtyl acetic acid
NOS Nopaline synthase teminator
OD Opitical density
PCR Polymerase Chain Reaction
RT – PCR
Reverse Transcriptase -
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng chuỗi polymerase
phiên mã ngược
WT Wild type Cây không chuyển gen 1


MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây cà chua có tên khoa học là Lycopesium esculentum, có nguồn gốc từ
Nam Mỹ, là loại rau ăn quả, họ Cà (Solanaceae). Quả có chứa nhiều vitamin C nên
có vị chua. Quả cà chua mọng, khi chín có màu vàng hoặc đỏ, có nhiều hình dạng:
tròn, dẹt, có cạnh, có múi, v.v. Cà chua được dùng trong chế biến thực phẩm, tạo vị
ngon và màu sắc hấp dẫn. Ngoài ra cà chua còn có tác dụng khá tốt trong việc chăm
sóc và bảo vệ sức khỏe. Lá cà chua có nơi dùng chữa bệnh về huyết áp và các bệnh
ngoài da.
Ở nước ta việc phát triển trồng cà chua còn có ý nghĩa quan trọng về mặt
luân canh, tăng vụ và tăng năng suất trên đơn vị diện tích, do đó cà chua là loại rau
được khuyến khích phát triển. Diện tích trồng cà chua lên đến chục ngàn ha, tập
trung chủ yếu ở đồng bằng và trung du phía Bắc. Tuy nhiên, việc trồng cà chua
chưa được phát triển mạnh theo mong muốn vì cà chua trồng trong điều kiện nóng
và ẩm ở nước ta dễ mắc nhiều bệnh gây hại đáng kể như héo tươi, virus, . khó
phòng trị.
Các nghiên cứu trong lĩnh vực nông nghiệp đều cho thấy tổng sản lượng các
cây lương thực trên thế giới chỉ đạt 20% tiềm năng di truyền. Nguyên nhân chính
cho là do các stress của môi trường tác động lên cây trồng, hạn mất nước, hạn mặn
và lạnh đều gây lên sự mất nước nội bào trong mô thực vật.
chống chịu những yếu tố bất lợi phi
sinh học khác nhau,
trên.
Những tác động bất lợi từ môi trường như khô hạn, đất nhiễm mặn, ngập úng,
nhiệt độ cực đoan thường làm mất cân bằng về áp suất thẩm thấu gây ảnh hưởng
nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng của nhiều loài cây trồng [30]. Một trong
những phản ứng thường gặp nhất khi cây gặp các điều kiện bất lợi về nước đó là tăng
cường tổng hợp và tích lũy các chất chuyển hóa như các loại đường tan, axit amin để
tăng cường áp suất thẩm thấu cho tế bào. Glycine betaine được biết đến là một trong 2


những chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội
bào khi thực vật sống trong các điều kiện bất lợi như khô, hạn, lạnh [47].
Ứng dụng kĩ thuật chuyển gen trong việc nghiên cứu nhằm tăng cường khả
năng chống chịu của cây trồng bằng cách kích thích cây trồng tổng hợp các chất
thẩm thấu tương thích giúp tế bào có thể vượt qua các điều kiện cực đoan. Vì vai trò
quan trọng của các chất tạo áp suất thẩm thấu để đáp ứng với áp lực môi trường ở
thực vật, cây trồng gặp điều kiện bất lợi có thể được tăng cường bằng tăng tích lũy
các chất hòa tan tương thích thông qua nhân giống cây trồng truyền thống, lựa chọn
sự trợ giúp của marker hoặc kỹ thuật di truyền. Một trong các gen được sử dụng để
chuyển vào cây trồng là codA giúp cây tự tổng hợp và tích lũy Glycine betaine.
Xuất phát từ thực trạng đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên
cứu chuyển cấu trúc mang gen codA vào cây cà chua”.
2. Mục tiêu nghiên cứu: Tạo được cây cà chua mang gen codA
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Chuyển gen codA vào lá mầm cà chua thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
(2) Tái sinh in vitro, chọn lọc và tạo các dòng cây cà chua chuyển gen mang gen
codA
(3) Phân tích và đánh giá cây chuyển gen