Thạc Sĩ Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế Conessin, Kaempferol, Nuciferin từ dược liệu làm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI 2012

MỤC LỤC (Luận án dài 201 trang có File WORD)


ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Xu thế phát triển thuốc có nguồn gốc thiên nhiên 3
1.2. Tổng quan về các đối tượng nghiên cứu 7
1.2.1. Về hợp chất Conessin và cây Mức hoa trắng 7
1.2.2. Về hợp chất Kaempferol và cây Đơn lá đỏ 12
1.2.3. Về hợp chất Nuciferin và cây Sen 16
1.3. Phương pháp thiết lập chất chuẩn đối chiếu từ dược liệu 22
1.3.1. Phương pháp thiết lập chất chuẩn đối chiếu 22
1.3.2. Hoạt động thiết lập chất chuẩn đối chiếu của các Hội đồng Dược điển, của khu vực ASEAN và Việt Nam 29
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu 33
2.1.1. Nguyên liệu 33
2.1.2. Hóa chất, thuốc thử 34
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ 34
2.2. Phương pháp nghiên cứu 35
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 36
2.2.2. Thiết kế thí nghiệm 37
2.2.3. Chiết xuất, phân lập, tinh chế 37
2.2.4. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất 40
2.2.5. Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất 40
2.2.6. Thiết lập chất chuẩn và xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất chuẩn 41

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 49
3.1. Chiết xuất, phân lập và tinh chế các hợp chất tự nhiên từ dược liệu 49
3.1.1. Chiết xuất, phân lập và tinh chế Conessin từ Mức hoa trắng 49
3.1.2. Chiết xuất, phân lập và tinh chế Kaempferol từ Đơn lá đỏ 56
3.1.3. Chiết xuất, phân lập và tinh chế Nuciferin từ lá Sen 65
3.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng và xác định độ tinh khiết của các chất 69
3.2.1. Đặc điểm cảm quan 69
3.2.2. Điểm chảy 70
3.2.3. Kết quả đo phổ 70
3.2.4. Xác định độ tinh khiết bằng quét nhiệt vi sai 76
3.3. Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu 78
3.3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích 78
3.3.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng đánh giá chất chuẩn 87
3.3.3. Áp dụng tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp phân tích đã được thẩm định để xác định chất lượng nguyên liệu thiết lập chuẩn 88
3.3.4. Đóng gói và đánh giá đồng nhất lô 96
3.3.5. Đánh giá liên phòng thí nghiệm và xác định giá trị ấn định 97
3.4. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của chất chuẩn đối chiếu 100
3.4.1. Đề cương nghiên cứu độ ổn định 100
3.4.2. Kết quả đánh giá độ ổn định của các chất chuẩn đối chiếu sau 9 tháng 102
3.4.3. Kết quả đánh giá độ ổn định của các chất chuẩn đối chiếu sau 15 tháng 106
3.5. Kết quả ứng dụng chất chuẩn đối chiếu 107
3.5.1. Định lượng Kaempferol trong dược liệu 108
3.5.2. Định lượng Conessin trong chế phẩm đông dược 115
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1. Về việc lựa chọn đối tượng nghiên cứu 124
4.2. Về các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng 124
4.2.1. Nhóm các phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế
4.2.2. Nhóm các phương pháp nhận dạng, xác định độ tinh khiết
4.2.3. Phương pháp định lượng và xác định tạp chất liên quan 127
4.3. Về qui trình chiết xuất, phân lập và tinh chế 128
4.3.1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế Conessin 128
4.3.2. Chiết xuất, phân lập, tinh chế Kaempferol 130
4.3.3. Chiết xuất, phân lập, tinh chế Nuciferin 131
4.4. Về bộ dữ liệu nhận dạng và độ tinh khiết của các hợp chất 133
4.4.1. Về bộ dữ liệu đo phổ 133
4.4.2. Về độ tinh khiết xác định bằng kĩ thuật quét nhiệt vi sai 133
4.5. Về kết quả nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu 133
4.5.1. Về tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn đối chiếu 133
4.5.2. Về qui trình đánh giá chất lượng của chất chuẩn đối chiếu 135
4.5.3. Về qui trình đóng gói và đánh giá độ đồng nhất lô 136
4.6. Về độ ổn định của chất chuẩn đối chiếu 136
4.6.1. Về độ ổn định ở thời điểm 9 tháng 137
4.6.2. Về độ ổn định ở thời điểm 15 tháng 138
4.7. Về việc ứng dụng các chất chuẩn đối chiếu 139
4.7.1. Định lượng Kaempferol trong dược liệu 139
4.7.2. Định lượng Conessin trong chế phẩm đông dược 140
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 141
Kết luận 141
Đề xuất 142


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết alcaloid toàn phần từ vỏ thân Mức hoa trắng. 50
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hàm lượng cắn flavonoid toàn phần từ đơn lá đỏ 57
Bảng 3.3. Hàm lượng Kaempferol trung bình trong cắn EtOAc 59
Bảng 3.4. Hàm lượng Kaempferol có thể chiết xuất được từ Đơn lá đỏ 60
Bảng 3.5. Thành phần và thể tích các hệ dung môi giải hấp phụ cột silicagel 62
Bảng 3.6. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc kí của Kaempferol tinh chế được với các hệ dung môi I, II, III 65
Bảng 3.7. Hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá Sen thu được bằng hai phương pháp chiết 66
Bảng 3.8. Đặc điểm cảm quan của các chất 69
Bảng 3.9. Kết quả đo điểm chảy 70
Bảng 3.10. Kết quả đo phổ tử ngoại khả kiến 71
Bảng 3.11. Kết quả đo phổ hồng ngoại 71
Bảng 3.12. Kết quả đo phổ khối lượng (ESI-MS) 72
Bảng 3.13. Kết quả phân tích phổ NMR của Conessin 73
Bảng 3.14. Kết quả phân tích phổ NMR của Kaempferol 74
Bảng 3.15. Kết quả phân tích phổ NMR của Nuciferin 75
Bảng 3.16. Kết quả xác định độ tinh khiết bằng quét nhiệt vi sai 76
Bảng 3.17. Loại cột HPLC đã khảo sát xây dựng phương pháp phân tích 78
Bảng 3.18. Khảo sát pha động và thành phần pha động 78
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát bước sóng phát hiện 80
Bảng 3.20. Một số thông số thể hiện sự phù hợp của hệ HPLC đã lựa chọn 80
Bảng 3.21. Kết quả khảo sát độ chính xác của 3 chất 83
Bảng 3.22. Kết quả khảo sát tính tuyến tính với Conessin 84
Bảng 3.23. Kết quả khảo sát tính tuyến tính với Kaempferol 84
Bảng 3.24. Kết quả khảo sát tính tuyến tính với Nuciferin 84
Bảng 3.25. Kết quả khảo sát độ đúng của 3 chất 85
Bảng 3.26. Kết quả khảo sát LOD và LOQ (µg/ml) 86
Bảng 3.27. Chương trình sắc kí để định lượng và xác định tạp chất trong nguyên liệu thiết lập chuẩn 87
Bảng 3.28. Tóm tắt các chỉ tiêu và phương pháp thử của các chất đối chiếu 88
Bảng 3.29. Điểm chảy của các hợp chất dùng làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn 89
Bảng 3.30. Kết quả phân tích tạp chất trong nguyên liệu Conessin 90
Bảng 3.31. Kết quả phân tích tạp chất trong nguyên liệu Kaempferol 90
Bảng 3.32. Kết quả phân tích tạp chất trong nguyên liệu Nuciferin 91
Bảng 3.33. Kết quả định lượng Conessin nguyên liệu thiết lập chuẩn 95
Bảng 3.34. Kết quả định lượng Kaempferol nguyên liệu thiết lập chuẩn 95
Bảng 3.35. Kết quả định lượng Nuciferin nguyên liệu thiết lập chuẩn 96
Bảng 3.36. Kết quả đánh giá độ đồng nhất lô 97
Bảng 3.37. Kết quả hàm lượng công bố và số lượng của các chất chuẩn đã thiết lập được 98
Bảng 3.38. Các chỉ tiêu chất lượng đánh giá và giới hạn chấp nhận 100
Bảng 3.39. Các giá trị tại thời điểm ban đầu 102
Bảng 3.40. Kết quả phân tích tạp chất liên quan của Conessin sau 9 tháng 102
Bảng 3.41. Kết quả bán định lượng Conessin sau 9 tháng 103
Bảng 3.42. Kết quả phân tích tạp chất liên quan của Kaempferol sau 9 tháng 104
Bảng 3.43. Kết quả định lượng Kaempferol sau 9 tháng 104
Bảng 3.44. Kết quả phân tích tạp chất liên quan của Nuciferin sau 9 tháng 105
Bảng 3.45. Kết quả định lượng Nuciferin sau 9 tháng 105
Bảng 3.46. Kết quả phân tích tạp chất liên quan của Conessin sau 15 tháng 106
Bảng 3.47. Kết quả phân tích tạp chất liên quan của Kaempferol sau 15 tháng 106
Bảng 3.48. Kết quả phân tích tạp chất liên quan của Nuciferin sau 15 tháng 107
Bảng 3.49. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí định lượng
Kaempferol trong lá Đơn lá đỏ 109
Bảng 3.50. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng Kaempferol trong dược liệu Đơn lá đỏ
Bảng 3.51. Kết quả xác định khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng Kaempferol trong dược liệu Đơn lá đỏ
Bảng 3.52. Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp định lượng Kaempferol trong dược liệu Đơn lá đỏ 112
Bảng 3.53. Kết quả định lượng Kaempferol trong dược liệu Chè vằng 114
Bảng 3.54. Chương trình gradient dung môi định lượng Conessin trong viên nén Mộc hoa trắng HT 116
Bảng 3.55. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí định lượng Conessin trong viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT 117
Bảng 3.56. Khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng Conessin trongviên nén bao phim Mộc hoa trắng HT 120
Bảng 3.57. Khảo sát độ chính xác trung gian (khác ngày) của phương pháp định lượng Conessin trong viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT 121
Bảng 3.58. Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng Conessin trong viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT 121
Bảng 3.59. Khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Conessin trong viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT 122
Bảng 3.60. Kết quả khảo sát LOD của phương pháp định lượng Conessin trong viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT 123
Bảng 4.1. Kết quả đạt được của nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế 132
Bảng 4.2. Số liệu thẩm định phương pháp HPLC 135
Bảng 4.3. Tóm tắt kết quả nghiên cứu độ ổn định sau 9 tháng 138
Bảng 4.4. Tóm tắt kết quả nghiên cứu độ ổn định sau 9 tháng và 15 tháng 138

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Số nước thành viên của WHO đã có qui chế quản lí thuốc từ dược liệu 5
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Conessin 7
Hình 1.3. Ảnh cây Mức hoa trắng 11
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Kaempferol 13
Hình 1.5. Ảnh cây Đơn lá đỏ 15
Hình 1.6. Công thức cấu tạo của Nuciferin 17
Hình 1.7. Ảnh cây Sen 19
Hình 1.8. Sự phát triển số lượng EPCRS 30
Hình 1.9. Phân bố nhu cầu sử dụng EPCRS theo khu vực địa lí 30
Hình 1.10. Hình ảnh USPRS 30
Hình 1.11. Hình ảnh ACRS 31
Hình 1.12. Chất chuẩn đối chiếu hóa học Cefuroxim acetil 31
Hình 1.13. Chất chuẩn đối chiếu hóa học Acid Chlorogenic 31
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 36
Hình 3.1. Kiểm tra khối lượng phân tử của Conessin bằng phổ khối (ESI-MS) 56
Hình 3.2. SKĐ các dịch chiết Kaempferol từ Đơn lá đỏ 58
Hình 3.3. SKĐ các phân đoạn phân lập Kaempferol 62
Hình 3.4. SKĐ của Keampferol tinh chế được với các hệ dung môi 64
Hình 3.5. Kiểm tra khối lượng phân tử của Nuciferin bằng phổ khối (ESI-MS) 69
Hình 3.6. Nhiệt đồ của mẫu Conessin 77
Hình 3.7. Nhiệt đồ của mẫu Kaempferol 77
Hình 3.8. Nhiệt đồ của mẫu Nuciferin 77
Hình 3.9. SKĐ và phổ UV của dung dịch đối chiếu Conessin 79
Hình 3.10. SKĐ và phổ UV của dung dịch đối chiếu Kaempferol 79
Hình 3.11. SKĐ và phổ UV cùa dung dịch đối chiếu Nuciferin 80
Hình 3.12. Dữ liệu độ tinh khiết pic Conessin 81
Hình 3.13. Dữ liệu độ tinh khiết pic Kaempferol 82
Hình 3.14. Dữ liệu độ tinh khiết pic Nuciferin 82
Hình 3.15. SKĐ xác định tạp chất của mẫu Conessin 92
Hình 3.16.SKĐ mẫu trắng trong xác định tạp chất của mẫu Conessin
Hình 3.17.SKĐ xác định tạp chất của mẫu Kaempferol
Hình 3.18.SKĐ mẫu trắng trong xác định tạp chất của mẫu Kaempferol
Hình 3.19.SKĐ xác định tạp chất của mẫu Nuciferin
Hình 3.20.SKĐ mẫu trắng trong xác định tạp chất của mẫu Nuciferin
Hình 3.21.Ảnh chất chuẩn đối chiếu Conessin
Hình 3.22.Ảnh chất chuẩn đối chiếu Kaempferol
Hình 3.23.Ảnh chất chuẩn đối chiếu Nuciferin
Hình 3.24.SKĐ dung dịch chuẩn Kaempferol 0,025 mg/ml
Hình 3.25.SKĐ dịch chiết đơn lá đỏ
Hình 3.26.Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp định
Kaempferol trong dược liệu Đơn lá đỏ
Hình 3.27. SKĐ tại giới hạn định lượng Kaempferol trong dược liệu Đơn lá đỏ 113
Hình 3.28. SKĐ định lượng Kaempferol trong dược liệu Đơn lá đỏ. 113
Hình 3.29. SKĐ định lượng Kaempferol trong dược liệu Chè vằng 115
Hình 3.30. SKĐ khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng Conessin
trong viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT 118
Hình 3.31. Phổ UV và độ tinh khiết pic hoạt chất trong dung dịch mẫu thử viên
nén bao phim Mộc hoa trắng HT 119
Hình 3.32. SKĐ định lượng Conessin trong viên nén bao phim
Mộc hoa trắng HT 120
Hình 3.33. Khảo sát tính tuyến tính của phương pháp định lượng Conessin trong
viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT 121

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong vòng hai thập kỉ gần đây, xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dược để phòng và trị bệnh trở nên phổ biến. Dược điển các nước khu vực châu Á như Việt Nam, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản đều có các chuyên luận về dược liệu. Một số chuyên luận dược liệu cũng đã được đưa vào Dược điển Mĩ, châu Âu . Theo ước tính, 70% dân số toàn cầu vẫn sử dụng thuốc từ dược liệu trong chăm sóc sức khỏe ban đầu tại cộng đồng. Vì vậy, tổ chức y tế thế giới đã nhấn mạnh việc đảm bảo chất lượng của các thuốc này phải dựa trên các kĩ thuật phân tích hiện đại, với việc sử dụng các chất chuẩn đối chiếu phù hợp.
Dược điển Việt Nam lần 3 (năm 2002) có 312 chuyên luận dược liệu và thuốc từ dược liệu. Trong số 275 chuyên luận dược liệu có 48 chuyên luận sử dụng chất chuẩn đối chiếu chiết ra từ dược liệu. Dược điển Việt Nam lần 4 (năm 2009) có 314 chuyên luận dược liệu và thuốc từ dược liệu. Hiện nay, tiêu chuẩn cơ sở của nhiều thành phẩm được xây dựng dựa trên việc định lượng hỗn hợp toàn phần bằng các phương pháp không đặc hiệu mà không định lượng được các hợp chất chính, đặc trưng, được coi là các hợp chất có hoạt tính sinh học do thiếu chất chuẩn đối chiếu. Do đó, việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu từ dược liệu ngày càng trở nên cần thiết đối với công tác đảm bảo chất lượng thuốc, từ giai đoạn lựa chọn nguyên liệu đầu vào, đến việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở, cũng như giám sát chất lượng thuốc lưu hành của cơ quan quản lí. Xuất phát từ thực tế này, luận án “Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế Conessin, Kaempferol, Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc” được thực hiện với ba mục tiêu sau:
1. Xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập, tinh chế 03 hợp chất tự nhiên
đặc trưng từ dược liệu là Conessin, Kaempferol và Nuciferin đạt độ tinh khiết trên 95% để sử dụng làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn đối chiếu.
2. Thiết lập 03 chất chuẩn đối chiếu có nguồn gốc dược liệu trên.
3. Ứng dụng các chất chuẩn đối chiếu thiết lập được để đánh giá chất lượng một số dược liệu và chế phẩm đông dược.


Để đạt được 3 mục tiêu trên, luận án đã tiến hành 5 nội dung chính sau đây:
1. Xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập, tinh chế Conessin từ vỏ thân cây Mức hoa trắng, Nuciferin từ lá cây Sen, Kaempferol từ lá cây Đơn lá đỏ đạt độ tinh khiết trên 95%, với khối lượng mỗi hợp chất tinh khiết là 02 gam.
2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất.
3. Xây dựng các chỉ tiêu chất lượng của chất chuẩn đối chiếu và phương pháp phân tích để đánh giá chất lượng của chất chuẩn đối chiếu.
4. Nghiên cứu độ ổn định của 03 chất chuẩn đối chiếu trong điều kiện bảo quản 2 – 80C.
5. Ứng dụng chất chuẩn đối chiếu thiết lập được để xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Kaempferol trong dược liệu lá cây Đơn lá đỏ, lá cây Chè vằng, Conessin trong viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT.