Luận Văn Nghiên cứu chiết xuất dịch chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Nghiên cứu chiết xuất dịch chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN----------------------------------------------------------------------------------i
MỤC LỤC-------------------------------------------------------------------------------------- ii
DANH MỤC BẢNG------------------------------------------------------------------------- iv
DANH MỤC HÌNH-------------------------------------------------------------------------- vi
LỜI MỞ ĐẦU --1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN --3
1.1. Giới thiệu về cây ngô (cây bắp) . --4
1.1.1. Đặc điểm hình thái cây ngô . --4
1.1.2. Đặc tính trồng trọt . --5
1.1.3. Sản lượng ngô trong nước và trên thế giới --5
1.2. Chlorophyll, hoạt tính chống oxy hóa và ứng dụng --8
1.2.1. Đặc tính của chlorophyll . --8
1.2.2. Lịch sử nghiên cứu chlorophyll . --8
1.2.3. Cấu trúc và quá trình sinh tổng hợp chlorophyll --9
1.2.4. Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll -----11
1.2.5. Tác dụng của chlorophyll -------------13
1.2.6. Một số sản phẩm về chlorophyll trên thị trường: . --14
1.3. Tình hình nghiên cứu chlorophyll trong nước và trên thế giới --16
1.3.1. Trong nước . --16
1.3.2. Trên thế giới . --16
1.4. Các phương pháp chiết tách và xác định chlorophyll, ưu nhược điểm --22
1.4.1. Các phương pháp chiết tách chlorophyll . --23
1.4.2. Các phương pháp xác định chlorophyll . --26
1.5. Mô hình thiết kế thí nghiệm Box-Behnken --28
1.5.1. Cơ sở lý thuyết --28
1.5.2. Các bước tiến hành . --30
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU-----------------32
2.1. Nguyên liệu . --33
2.2. Phương pháp nghiên cứu . --33
2.2.1. Phương pháp định lượng . --33
2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa --34
2.2.3. Phân tích và xử lý số liệu --34
2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm --35
2.2.5. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa-------------------------------------------------------- 41
2.3. Dụng cụ và hóa chất------------------------------------------------------------------- 42
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . --43
3.1. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa
của chlorophyll . --44
3.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy
hóa của chlorophyll --46
iii
3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: nguyên liệu đến hàm lượng và hoạt tính chống
oxy hóa của chlorophyll . --48
3.4. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của
chlorophyll sau chlorophyll --50
3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của
chlorophyll . --53
3.6. Tối ưu hóa công đoạn chiết dịch chlorophyll chống oxy hóa --55
3.7. Đề xuất qui trình chiết rút chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp------------61
3.8. Đánh giá sơ bộ hiệu suất thu nhận chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp--63
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ --64
iv
DANH MỤC BẢNG
STT TÊN BẢNG TRANG
1
Bảng1.1. Diện tích, năng suất, sản lượng ngôtrên thế
giới (1961-2007)
6
2
Bảng1.2. Sản xuất ngô Việt Nam (1961-2007)
7
3
Bảng1.3. Các cấu trúc khác nhau của phân tử
chlorophyll.
10
4
Bảng2.1. Bảng quy đổi biến mã và biến thực
41
5
Bảng2.2.Thiết kế thí nghiệm theo biến mã và biến thực
sử dụng mô hình Box-Behnken
41
6 Bảng 3.1. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa 55
7
Bảng3.2. Bảng thể hiện độ lệch chuẩn, độ tương tác và
F của các yếu tố
56
8
Bảng3.3. Bảng thể hiện xác suất và hệ số mô hình của
hai hàm mục tiêu
56
v
DANH MỤC HÌNH
STT TÊN HÌNH TRANG
1
Hình1.1. Sự phân bố chlorophyll trung bình trên bề mặt
nước biển (mg chl m
-3
).
8
2
Hình1.2. Cấu trúc các phân tử chlorophyll.
10
3
Hình1.3. Các sản phẩm về chlorophyll trên thị trường
15
4
Hình 1.4. Thống kê các phương pháp nghiên cứu
chlorophyll.
17
5
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
35
6
Hình2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại dung môi
chiết
36
7
Hình2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ dung
môi chiết
37
8 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ dung môi/
nguyên liệu
38
9 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết
39
10
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiết độ chiết
40
11
Hình 3.1. Ảnh hưởng của loại dung môi đến hàm lượng
chlorophyll
44
12
Hình3.2. Ảnh hưởng của loại dung môi đến hoạt tính
chống oxy hóa của chlorophyll
44
13
Hình3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dungmôi đến hàm
lượng chlorophyll
46
14
Hình3.4. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hoạt
46
vi
tính chống oxy hóa chlorophyll
15
Hình3.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu đến
hàm lượng chlorophyll
48
16
Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi đến
hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll
49
17
Hình3.7. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng
chlorophyll
50
18
Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính
chống oxy hóa của chlorophyll
51
19
Hình3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng
chlorophyll
53
20
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính
chống oxy hóa của chlorophyll
54
21 Hình3.11. Mô hình bề mặt 3D của hàm mục tiêu Y
1
57
22 Hình3.12. Mô hình bề mặt 3D của hàm mục tiêu Y
2
58
23
Hình3.13a. Đồ thị 2D thể hiện sự tương tác giữa 3 yếu tố
lên hàm mục tiêu Y
1
58
24
Hình3.13b. Đồ thị 2D thể hiện sự tương tác giữa 3 yếu tố
lên hàm mụctiêu Y
2
58
25
Hình 3.14. Mô hình bề mặt 2D trùng lắp của 2 hàm mục
tiêu Y
1
và Y2
59
26
Hình 3.15.Quy trình đề xuất chiết chlorophyll từ lá bắp 61
27
Hình 3.16. Hàm lượng chlorophyll sau mỗi lần chiết 63
28
Hình 3.17. Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll sau
mỗi lần chiết
63
1
LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay sự biến đổi khí hậu và môi trường toàn cầu đang ở mức đáng báo
động cao. Con người luôn có thể phải tiếp xúc với phóng xạ, các bức xạ năng lượng
cao, ngộ độc, nhiễm độc thức ăn, nấm mốc, thuốc bảo vệ thực vật, thuốcdiệt cỏ
(dioxin), tia tử ngoại, khói thuốc lá (mỗi hơi thuốc lá sản sinh khoảng 114gốc tự
do), stress, dư thừa chất béo . Chính các yếu tố trên đã làm tăng nhanh quá trình
lão hóa và mắc bệnh cho con người, như ung thư, Alzehmer, .
Chuyên gia nghiên cứu về hồng huyết cầu và khoa học gia từng đoạt giải
Nobel, Bác Sĩ Hans Frischer, đã khám phá ra cấutrúc của hồng huyết cầu rất giống
như cấu trúc của Chlorophyll. Trong cơ thể con người, hồng huyết cầu có nhiệm vụ
chuyển tải dưỡng khícho cơ thể với chất sắt (Fe) là nhân tố của hồng huyết cầu
trong khi magnesium (Mg) là nhân tố của Chlorophyll. Chính điều này giúp cơ thể
chúng ta biến đổi chlorophyll thành hồng huyết cầu làm gia tăng chỉ số hồng huyết
cầu trong cơ thể, bổ gan, hoá giải các độc tố và tiêu trừ các chất độc trong máu.
Gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy, chlorophyll có tác dụng như một chất
chống oxy hoá của cơ thể,cótác dụng làm chậm quá trình lão hoá (khảnăng: quét
các gốc DPPH, Hydroxyl, các anion,khử sắt, tạo phức chelat với các iôn hóa trị,
oxy hóa lipid), ngừa ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, trị vết thương
Cây bắp là một trong năm loại cây lương thực chủ đạo trên thế giới cũng như
ở Việt Nam. Năm 2009 chỉ tính riêng huyện Khánh Vĩnh, trong tổng số 2.680 ha
cây lương thực, diện tích trồng bắp trên địa bàn huyện đạt hơn 1.500 ha với năng
suất 32 –35 tạ/ ha.
Ở nước ta cây bắp chủ yếu được trồng để lấy hạt, còn thân cây, lá cây, vỏ
bắp và lụa bắpchủ yếu được làm thức ăn gia súc hoặc tồn tại ở dạng phế liệu nông
nghiệp gây ô nhiễm môi trường. Từ lá bắp, vỏ bắp, thu nhận chlorophyll, sau vẫn
có thể sử dụngphần còn lạiđể sản xuất nhiên liệu sinh học từ bã chiết.
Do vậy, tôi được Khoa Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nha Trang
phân công nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chiết xuất dịch chlorophyll chống oxy
2
hóa từ lá bắp”, với mục đích tận dụng lá bắp để thu nhận chlorophyll dùng trong
thực phẩm.
Nội dung đề tài:
1) Xác định một số thông số cho quá trình chiết rút chlorophyll chống oxy
hóa từ lá bắp: loại và nồng độ dung môi chiết, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu,
thời gian và nhiệt độ chiết;
2)Đề xuất qui trình chiết rút chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp;
3)Sơ bộ đánh giá hiệu suất thu nhận chlorophyll chống oxy hóa từ lábắp;
Do thời gian nghiên cứu có hạn và lần đầu làm quen với nghiên cứu
chlorophyll. Do vậy đồ án này chắc hẳn sẽ còn có những hạn chế. Em rất mong
nhận được ý kiến đóng góp của quý thấy cô và bạn bè để nghiên cứu này thêm hoàn
thiện. Xin chân thành cảm ơn.
3
Chương 1
TỔNG QUAN
4
1.1. Giới thiệuvề câyngô (cây bắp)
Ngô, bắphay bẹ(danh pháp khoa học: Zea mays L. ssp. mays) là loại cây
lương thực thuần canh bắt nguồn ở Trung Mỹ, sau đó được trồng phổ biến ở châu
Mỹ. Cuối thế kỷ 15đầu thế kỷ 16, khi có tiếp xúc của người châu Âu với châu Mỹ,
bắp đã được trồng phổ biến trên toàn thế giới.
1.1.1. Đặc điểm hình thái cây ngô[39]
Một vài giống ngô có thể cao tới 7m, còn chiều cao các giống ngô thương
phẩm chỉ khoảng 2,5mvà ngô ngọt(Zea maysvar. rugosahay Zea maysvar.
saccharata) thường thấp hơn.
Cây ngô có hình thái phát triển rất khác biệt; các lá hình mũi mác rộng bản,
dài 50 –100cm, rộng 5 -10cm; thân thẳng, thường cao 2–3 m, nhiều mấu, với các
lá tỏa ra từ mỗi mấu với bẹ nhẵn. Bắp ngô ôm sát thân cây và nằm dưới lá. Khi còn
non chúng dài ra khoảng 3cm mỗi ngày. Từ các đốt ở phía dưới sinh ra một số rễ.
Thâncây ngô cóđốt với các khớp (mấuhay mắt), các khớp cách nhau khoảng 20 –
30cm, trông tương tự thân cây tre.
Các bắp ngô (bẹ ngô) là các cụm hoa cái hình bông, được bao bọc trong một
số lớp lá, và bao chặt vào thân. Chúng không lộ ra cho đến khi xuất hiện các râu
ngô màu vàng hung từ vòng lá vào cuối của bắp ngô. Râu ngô là các núm nhụy
thuôn dài trông giống như một búi tóc, ban đầu màu xanh lục và sau đó chuyển dần
sang màu hung đỏ hay hung vàng.
Trên đỉnh của thân cây là cụm hoa đuôi sóc hình chùy chứa các hoa đực,
được gọi là cờ ngô. Mỗi râu ngô đều có thể được thụ phấn để tạo ra một hạt ngô
trên bắp. Các bắp ngô non có thể dùng làm rau ăn với toàn bộ lõi và râu, nhưng khi
bắp đã già (thường là vài tháng sau khi trổ hoa) thì lõi ngô trở nên cứng và râu thì
khô đi nên không ăn được.
Các hạt ngô là các dạng quả thócvới vỏ quảhợp nhất với lớp áo hạt, là kiểu
quả thông thường ở họ Hòa thảo(Poaceae),gần giống loại quả phứcvề cấu trúc,
ngoại trừ là các hạtriêng biệt không bao giờ hợp nhất thành một khối. Hạt ngô có
kích thước cỡ hạt đậu Hà Lan, bám chặt thành hàng tương đối đều xung quanh một
5
lõi trắng để tạo ra bắp ngô. Mỗi bắp ngô dài khoảng 10 –25cm, cókhoảng 200 -400 hạt. Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng, khi được nghiền
thành bột, ngô tạo ra nhiều bột và ít cám hơn so với lúa mì. Tuy nhiên, chúng không
có glutennhư lúa mì nên có độ trương nở nhỏ hơn khi sử dụngcho các thức ăn dạng
nướng [39].
1.1.2.Đặc tính trồng trọt[39]
Ngô cần thời gian ban đêm dài và ra hoa trongmôi trường phù hợp với nhiệt
độ lớn hơn 10°C (50°F) và biên độ ảnh hưởng này được quyếtđịnh theo di truyền
và được điều chỉnh bởi hệ thống sắc tố thực vật.Tính chu kỳ theo ánh sáng có thể bị
sai lệch đối vớicác giống cây trồng ở khu vực nhiệt đới (thời gian ban ngày kéo dài
làm cho cây phát triển rất cao và không đủ thời gian ra hoa, tạo hạt trước khi bị chết
vì sương giá).Tuy nhiên, đặc tính này hữu ích khi sử dụng ngô làm nguồn cung cấp
nhiên liệu sinh học
Do ngô chịu lạnh kém nên ở khu vực ôn đới, ngô thường được trồng vào
mùa xuân. Hệ thống rễ nông, nên phụ thuộc nhiều vào độ ẩm của đất. Là một loại
thực vật C4(thực vật cócơ chế quang hợp C4), nên chúng sử dụng nướchiệu quả
hơn so với thực vật C3như (cỏ linh lănghay đậu tương). Chúng nhạy cảm nhất với
khô hạn khi trổ bắp, lúc hoa (râu) ngô đã sẵn sàng cho việc thụ phấn. Tại Hoa Kỳ,
vụ thu hoạch bội thu theo truyền thống được dự đoán là khi ngô "cao ngang đầu gối
vào ngày 4 tháng 7", mặc dù các giống lai ghép hiện nay nói chung đều vượt quá tỷ
lệ phát triển này. Ngô sử dụng để làm cỏ ủ chuađược thu hoạch khi cây còn non và
bắp chưa già. Ngô ngọt được thu hoạch khi hạt ở "giai đoạn sữa", sau khi thụ phấn
nhưng trước khi hình thành tinh bột, ở Mỹ là vào khoảng cuối mùa hè, đầu đến giữa
mùa thu [39].
1.1.3.Sản lượng ngô trong nướcvà trên thế giới[38]
 Trên thế giới
Ngô là cây lương thực được gieo trồng nhiều nhất tại châu Mỹ (riêng tại Hoa
Kỳ, sản lượng là khoảng 270 triệu tấn/ năm). Các giống ngô lai được ưa chuộng hơn
so với các giống ngô thông thường,do năng suất cao.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt
1.Đặng Văn Giáp (2002), Thiết kế & tối ưu hóa công thức và quy trình, NxbY học,
Hà Nội.
Tiếng Anh
2. Adams, Jad, (2004), Hideous absinthe: Ahistory of the devil in a bottle, Madison,
Wisconsin: University of Wisconsin Press, 22.
3. A. Gitelson, Y. Grits, D. Etzion, (2000), Optimal properties of Nannochloropsis
sp and application to remote estimation of cell mass, Biotechnology Bioengineering
69, 516.
4. Chen, Min, Schliep, Martin, Willows, Robert D. et al, (September 2010), A Red
Shifted Chlorophyll, Science 329 (5997), 131.
5. Chisti Y, Moo-Young M., (1986), Disruption of microbial cells for intracellular
products, Enzyme Microb Technol, 8, 194 –204.
6. Delépine, Marcel, (September 1951), Joseph Pelletier and Joseph Caventou,
Journal of Chemical Education, 28 (9), 454.
7. Dere S, Gunes T and Sivaci R., (1998), Spectrophotometric determination
of chlorophyll –A, B and total carotenoid contents of some algae species using
different solvents, Tr J Botany, 22, 13-17.
8. Dr. Richard L. Duble, (2010),Iron Chlorosis in Turfgrass,Professor and
Extension Turfgrass Specialist, Texas A&M University, 213-216.
9. Fleming Ian, (14 October 1967), Absolute Configuration and the Structure of
Chlorophyll, nature 216 (5111), 151–152.
10. F. Soxhlet,(1879). Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes,
Dingler’s Polytechnisches Journal, 232, 461-465.
11. George Box, Donald Behnken, (1960), Some new three level designs for the
study of quantitative variables, Technometrics, Volume 2, 455–475.
67
12. Gitelson, Anatoly A; Buschmann, Claus; Lichtenthaler, Hartmut K,(1999), The
Chlorophyll Fluorescence Ratio F735/F700 as an Accurate Measure of the
Chlorophyll Content in Plants, Remote Sensing of Environment 69 (3), 296.
13. G. Mackinney, (1941), Absorption of light by chlorophyll solutions, J. Biol.
Chem., 140, 315-322.
14. Higashi-Okai K, Yamazaki M, Nagamori H, Okai Y, (2001), Identification and
antioxidant activity of several pigments from the residual green tea (Camellia
sinensis) after hot water extraction, Pubmed, 23(4), 335-44.
15. Irijama, K., Shiraki, M., & Yoshiuma, M. (2011), An improvedmethod for
extraction, partial purification, separation and isolation of chlorophyll from
spinach leaves, Journal of Chromatography, 2, 2, 255-276.
16. Jeffrey S. W., Humphrey G.F., (1975), New spectrophotometric equations
for determining chlorophylls a, b, c1 and c2 in higher plants, algae and natural
phytoplankton, Biochem. Physiol. Pflanzen (BPP), 167.
17. Jeffrey, S. W.; Shibata, Kazuo,(1969), Some Spectral Characteristics of
Chlorophyll c from Tridacnacrocea Zooxanthellae, Biological
Bulletin (MarineBiologicalLaboratory), 136(1), 5462.
18. Karsten, U.,Schumann, R., Haubner, N., & Klausch, S. (2005), Chlorophyll
extraction methods for the quantification of green microalgae colonizing building
facades, International biodeterioration & Biodegradation, 55 (3), 213-222.
19. Laurence M. Harwood, Christopher J. Moody,(1987), Experimental organic
chemistry: Principles and Practice, Illustrated edition ed., 122-125.
20. L. Edler,(ed.), (1979), Recommendations for marine biological studies in the
Baltic Sea. Phytoplankton and chlorophyll, The Baltic Marine Biologists Publ. 5, 1-38.
21. Lichtenthaler H, Wellburn A,(1983), Determinations of total carotenoids and
chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents, Biochemical Society
Transactions,11, 591–592.
68
22. M.G. Ferruzzi, V. Böhm, P.D. Courtney, S.J. Schwartz, (September, 2002),.
Antioxidant and Antimutagenic Activity of Dietary Chlorophyll Derivatives
Determined by Radical Scavenging and Bacterial Reverse Mutagenesis Assays,
Volume 67, Issue 7, 2589–2595.
23. M. Pepe, C. Giardino, G. Borsani, (2001), Relationship between apparent
optical properties and photosynthetic pigments in the sub-alpine Lake Iseo, The
Science of the Total Environment,268(1-3), 31.
24. Müller, Thomas; Ulrich, Markus; Ongania, Karl-Hans; Kräutler, Bernhard
(2007), Colorless Tetrapyrrolic Chlorophyll Catabolites Found in Ripening Fruit
Are Effective Antioxidants, Angewandte Chemie 46 (45), 8699–8702.
25. Norbert Wasmund, I.T., Dirk Schories, (2006), Optimising the storage and
extraction of chlorophyll samples, Oceanologia, 48 (1), 125-144.
26. Panagiota Karageorgou and Yiannis Manetas, Tree Physiol, (2006), The
importance of being red when young: anthocyanins and the protection of young
leaves of Quercus coccifera from insect herbivory and excess light, 26 (5), 613-621.
27. Prieto, P., Pineda, M., & Aguilar, M, (1999), Spectrophotometric quantitation
of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex:
Specific application to the determination of vitamin E, Analytical Biochemistry,
269, 337–341.
28. Rebecca Christiana, Hari Kristopo, Leenawaty Limantara, (2008).
Photodegradation and antioxidant activity of chlorophyll a from spirulina
(spirulina sp.) powder, Indonesian journal of chemistry, 8(2), 236-241.
29. Ronen , R., & Galun, M, (1984), Pigment Extraction from Lichens with
Dimethylsulfoxide (Dmso) and Estimation of Chlorophyll Degradation,
Environmental and Experimental Botany, 24 (3), 239-245.
30. Speer, Brian R, (1997), Photosynthetic Pigments, UCMP Glossary (online),
University of California Museum of Paleontology,Retrieved 2010-07-17.
31. Strickland, J. D. H. and T. R. Parsons, (1968), A practical handbook of
seawater analysis.Bull. Fish. Res. Bd. Canada No. 167, 1-311.
69
32. UNESCO, (1966), Rep. SCOR/UNESCO WG 17, UNESCO, Paris, Monogr
Oceanogr Methodol, 1, 11.
33. Vollenweider, R. and J. Kerekes, (1982), Eutrophication of waters, Monitoring,
assessment and control OECD, Paris, 154.
34. Wellburn, A. R (1994), The spectral determination of chlorophyll a and
chlorophyll b, as well as total carotenoids, using various solvents with
spectrophotometers of different resolution. Journal of Plant Physiology, 144(3),
307-313.
35. Woodward, R. B.; Ayer, W. A.; Beaton, J. M.,(July 1960), The total synthesis
of chlorophyll, Journal of the American Chemical Society 82 (14), 3800–3802.
Các trang web đã tham khảo
36. http://www.baomuabanraovat.com/raovat/100914/nuoc-diep-luc-liquid-chlorophyll-qua-tang-cua-dat-troi-synergy
37. http://www.dietaryfiberfood.com/antioxidants/chlorophyll-health benefits.php
38. http://www.docstoc.com/docs/22163735/I-T%C3%ACnh-h%C3%ACnh-s%E1%BAA3n-xu%E1%BA%A5t-ng%C3%B4-tr%C3%AAn-th%E1%BA%BF-gi%E1%BB%9Bi
39. http://www.vi.wikipedia.org/wiki/Ng%C3%B4
40. http://www.water.iopan.gda.pl/~kaczmar/bdo/pigments.htm.
41. http://www.xetnghiemdakhoa.com/diendan/showthread.php?tid=75