Luận Văn Nghiên cứu chế tạo vacxin vô hoạt nhũ dầu nhị giá phòng bệnh Newcastle và viêm phế quản truyền nhiễm

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Nghiên cứu chế tạo vacxin vô hoạt nhũ dầu nhị giá phòng bệnh Newcastle và viêm phế quản truyền nhiễm ở gà


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CHỮVIẾT TẮT vi
DANH MỤC BẢNG viii
MỞĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀNGHIÊN CỨU . 3
1.1. Virus Newcastle . 3
1.1.1. Hình thái và các tính trạng lý, hóa 3
1.1.2. Cấu trúc hệgen 3
1.1.3. Protein . 4
1.1.4. Sức đềkháng . 4
1.1.5. Đặc tính nuôi cấy . 5
1.1.6. Độc lực 5
1.1.7. Sựnhân lên 6
1.1.8. Tính gây bệnh 7
1.1.9. Cơ chếsinh bệnh 8
1.2. Virus viêm phếquản truyền nhiễm gà (IBV) . 8
1.2.1. Hình thái và các tính trạng lý, hóa 8
1.2.2. Cấu trúc hệgen 9
1.2.3. Protein . 9
1.2.4. Sức đềkháng . 10
1.2.5. Đặc tính nuôi cấy . 11
iii
1.2.6. Độc lực 12
1.2.7. Sựnhân lên 13
1.2.8. Tính gây bệnh 13
1.2.9. Cơ chếsinh bệnh 13
1.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất vacxin 14
1.3.1. Trên thếgiới 14
1.3.2. ỞViệt Nam . 15
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. Vật liệu . 17
2.1.1. Giống Virus 17
2.1.2. Động vật thí nghiệm 17
2.1.3. Môi trường và hóa chất . 17
2.1.4. Thiết bị chuyên dụng . 18
2.2. Phương pháp . 18
2.2.1. Thử nghiệm HA (Haemagglutination Test) . 18
2.2.2. Tiêm vào xoang niệu mô . 19
2.2.3. Giám định đặc tính sinh học của virus Newcastle 19
2.2.3.1. Tiêm truyền giống virus Newcastle trên gà mẫn cảm 19
2.2.3.2. Xác định chỉ số EID
50, MDT . 19
2.2.3.3. Xác định chỉ số LD
50
. 21
2.2.3.4. Xác định chỉ số ICPI . 22
2.2.3.5. Xác định chỉ số IVPI . 22
2.2.4. Giám định đặc tính sinh học của IBV 23
iv
2.2.4.1. Tiêm truyền giống virus viêm phế quản truyền nhiễm trên gà mẫn
cảm 23
2.2.4.2. Xác định chỉ số EID
50
. 23
2.2.5. Nhân giống và thu hoạch virus Newcastle và IBV trên trứng gà có phôi 24
2.2.6. Xác định virus và chuẩn độvirus Newcastle và IBV trong nước trứng thu
được 25
2.2.7. Xác định hiệu giá kháng thểkháng virus Newcastle và IBV trong huyết
thanh gà được tiêm vacxin nhũ dầu . 25
2.2.8. Vô hoạt virus . 26
2.2.9. Kiểm tra vô hoạt . 26
2.2.10. Sản xuất vacxin 26
2.2.11. Kiểm tra chất lượng vacxin . 28
2.2.11.1. Vô trùng 28
2.2.11.2. Tiêu chuẩn về vật lý 28
2.2.11.3.Chỉ tiêu an toàn của vacxin trên gà 28
2.2.11.4.Hiệu lực 28
2.2.12. Xử lý số liệu 29
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 30
3.1. Giám định đặc tính sinh học của virus Newcastle . 30
3.1.1. Ổn định giống virus PV1 trên phôi gà . 30
3.1.2. Tiêm truyền giống virus PV1 trên gà mẫn cảm 31
3.1.3. Chuẩn độ giống virus PV1 trên phôi gà . 32
3.1.4. Chuẩn độ giống virus PV1 trên gà . 34
3.1.4.1. Xác định chỉ số LD
50
. 34
v
3.1.4.2. Tiêm não gà con 1 ngày tuổi . 35
3.2. Giám định đặc tính sinh học của IBV . 37
3.2.1. Ổn định giống virus MV trên phôi gà 37
3.2.2. Tiêm truyền giống virus MV trên gà mẫn cảm 38
3.2.3. Chuẩn độ giống virus MV trên phôi gà 39
3.3. Nhân giống và kiểm tra tiêu chuẩn giống . 41
3.3.1. Với giống virus Newcastle cường độc . 41
3.3.2. Với giống virus IB cường độc . 41
3.4. Chuẩn độvirus trên phôi gà . 43
3.5. Kiểm tra 2 giống virus (PV1 và MV) sau vô hoạt 43
3.6. Sản xuất vacxin 45
3.7. Kiểm tra vô trùng vacxin 45
3.8. Kiểm tra chỉ tiêu vật lý, an toàn của vacxin . 45
3.9. Kiểm tra hiệu lực vacxin trên gà 2 tháng tuổi 47
3.9.1. Theo dõi sựbiến động hàm lượng kháng thểkháng virus Newcastle và IB
trên gà 2 tháng tuổi chưa được miễn dịch cơ sở . 47
3.9.2. Theo dõi sựbiến động hàm lượng kháng thểkháng virus Newcastle và IB
trên gà 2 tháng tuổi đã được miễn dịch cơ sở 51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 61
vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BPL Betapropiolactone
CEK Chick Embryo Kidney
CEL Chick Embryo Liver
CK Chick Kidney
CPE Cytopathic Effect
CRD Chronic Respiratory Disease
EID50
Embryo Infective Dose 50%
FAO Food and Agriculture Organization
HA Haemagglutination Test
HI Haemagglutination Inhibition Test
HN Haemagglutinin -Neuraminidaza
IB Infectious Bronchitis
IBV Infectinous Bronchitis Virus
ICPI Intracerebral Pathogenicity Index
IVPI Intravenous Pathogenicity Index
LD50 Lethalis Dose 50%
MDa Megadalton
MDT Mean Dead Time
NP Nucleoprotein
vii
ORF Open Reading Frame
PBS Phosphate Buffered Saline
PMV-1 Paramyxovirus-1
RNP Ribonucleoprotein
viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng1.1. Chỉ số độc lực của một số chủng virus Newcastle 6
Bảng 2.1. Xác định chỉ số EID
50
20
Bảng 2.2. Xác định chỉ số LD
50
. 21
Bảng 2.3. Xác định chỉ số ICPI 22
Bảng 2.4. Xác định chỉ số IVPI . 23
Bảng 2.5. Xác định chỉ số EID
50
24
Bảng 3.1. Kết quả tiêm truyền giống PV1 trên phôi gà 30
Bảng 3.2. Kết quả tiêm truyền giống PV1 trên gà mẫn cảm . 31
Bảng 3.3. Kết quả xác định chỉ số EID
50
(log10) của giống PV1 lần 1 . 33
Bảng 3.4. Kết quả xác định chỉ số LD
50
(log10) của giống PV1 lần 1 34
Bảng 3.5. Kết quả xác định chỉ số ICPI bằng giống virus PV1 . 36
Bảng 3.6. Kết quả xác định chỉ số IVPI bằng chủng virus PV1 37
Bảng 3.7. Kết quả tiêm truyềngiống MV trên phôi gà . 37
Bảng 3.8. Kết quả tiêm truyền giống MV trên gà mẫn cảm 39
Bảng 3.9. Kết quả xác định chỉ số EID
50
(log10) của giống MV lần 1 . 40
Bảng 3.10. Kết quả kiểm tra virus sau vô hoạt trên phôi gà . 44
Bảng 3.11. Kết quả sản xuất vacxin . 45
Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra vô trùng vacxin . 45
Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra tính ổn định của vacxin . 46
Bảng 3.14. Kết quả kiểm tra an toàn của các lô vacxin nhũ dầu trên gà . 46
Bảng 3.15. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà 2 tháng tuổi
chưa được miễn dịch cơ sở newcastle 48
Bảng 3.16. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà 2 tháng tuổi chưa
được miễn dịch cơ sở IB 50
Bảng 3.17. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà 2 tháng tuổi
đã được miễn dịch cơ sở newcastle 52
Bảng 3.18. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà 2 tháng tuổi đã được
miễn dịch cơ sở IB . 54
ix
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh của NDV được chụp dưới kính hiển vi điện tử. 3
Hình 1.2. Hình ảnh của IBV được chụp dưới kính hiển vi điện tử . 8
Hình 2.1. Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin nhị giá ND & IB nhũ dầu . 27
Hình 3.1. Bệnh tích do virus cường độc Newcastle gây ra ở phôi gà . 42
Hình 3.2.Bệnh tích do virus cường độc IB gây ra ở phôi gà . 42
Hình 3.3. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà chưa được
miễn dịch cơ sở 49
Hình 3.4. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà chưa được miễn dịch
cơ sở . 51
Hình 3.5. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus newcastle ở gà đã được miễn
dịch cơ sở . 53
Hình 3.6. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà đã được miễn dịch cơ
sở . 55
Hình 3.7. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà chưa có miễn
dịch cơ sở và gà đã được miễn dịch cơ sở được tiêm vacxin lô 1 56
Hình 3.8. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà chưa có miễn dịch cơ
sở và gà đã được miễn dịch cơ sở được tiêm vacxin lô 1 56
1
MỞ ĐẦU
ỞViệt Nam hiện nay, chăn nuôi theo phương thức công nghiệp đang từng
bước dần thay thếphương thức chăn nuôi nhỏlẻtheo quy mô hộgia đình. Nuôi gia
cầm trong đó nuôi gà là một trong những nghềđược quan tâm hàng đầu, vì thời
gian nuôingắn thu được sản phẩm nhanh. Một trong những khâu quan trọng đểđảm
bảo chăn nuôi gà phát triển mạnh và có lãi là bảo vệcho đàn gà tránh khỏi dịch
bệnh.
Đồng thời với việc phát triển nghềchăn nuôi gà theo phương thức công
nghiệp, các bệnh truyền nhiễmnguy hiểm của gà cũng nảy sinh, gây thiệt hại cho
ngành chăn nuôi, như các bệnh: Bệnh Newcastle, bệnh Gumboro, bệnh Viêm phế
quản truyền nhiễm, bệnh hô hấp mãn tính (CRD), bệnh tụhuyết trùng đặc biệt là
bệnh Newcastle và bệnh Viêm phếquản truyền nhiễm đã được người chăn nuôi
quan tâm rất nhiều.
Bệnh Newcastle hay còn gọi là bệnh gà rù là một bệnh truyền nhiễm nguy
hiểm cấp tính,lây lan rộng của loài gà do một loại virus thuộc nhóm Paramyxovirus
gây ra (Bear & Hanson, 1980). Đặc điểm là gà ủrũ, kém hoạt động, bỏăn, lông xù
như khoát áo tơi, nền chuồng có nhiều bãi phân trắng; gà sốt cao 42 -43
0
C, chảy
nước mũi, khó thở, rối loạn tiêu hóa; có triệu chứng thần kinh. Ngoài ra, bệnh tích
điển hình là niêm mạc dạdày tuyến xuất huyết lấm tấm chấm màu đỏ, niêm mạc
ruột xuất huyết; niêm mạc miệng hầu, khí quản xuất huyết[2]. Bệnh viêm phếquản
truyền nhiễm gà do virus thuộc nhóm Coronavirus gây ra, là một bệnh truyền nhiễm
cấp tính, dễlây lan tiếp xúc với những triệu chứng đặc trưng ởđường hô hấp như
ho, chảy nước mũi, viêm hầu họng và dịch thẩm xuất tích tụnhiều ởniêm mạc khí
phếquản làm con vật khó thở, hắt hơi và có tiếng ran khí quản. Bệnh tích điển hình
là niêm mạc mũi, khí quản, phếquản và lòng phếnang xung huyết, chứa dịch.
Ngoài ra, bệnh có thể ảnh hưởng lớn đến sản lượng và chất lượng trứng ởđàn gà
đẻ[1],[2].
2
Các bệnh trên có tỷlệnhiễm cao và là một trong những nhân tốchính gây
giảm hiệu quảkinh tếđối với ngành chăn nuôi gà. Cho đến nay, bệnh chưa có thuốc
trị. Biện pháp tốt nhất đểkiểm soát dịch bệnh là thực hiện an toàn sinh học trong
chăn nuôi và sửdụng vacxinphòng bệnh[1],[2].
Tiêm phòng cho gà bằng vacxinnhược độc, đơn giá có ưu điểm làtạo miễn
dịch nhanh, hiệu lực miễn dịch cao.Tuynhiên, khi sửdụng vacxinđơn giá đểtiêm
phòng cần phải bắt gà nhiều lần, tạo phản ứng stress gây bất lợi cho gà, ảnh hưởng
tới năng suất sản xuất. Vacxinđa giá là giải pháp hữu hiệu trong việc phòng bệnh
cho gia cầm.
Trong công tác phòng bệnh cho gia cầm thì việc chếtạo vacxinđa giá vô
hoạt phòng bệnh cho gia cầm là xu thếhiện nay của các nhà sản xuất vacxintrên thế
giới hiện nay và lâu dài. Đểgiảm bớt những nhược điểm khi tiêm phòng bằng
vacxinnhược độc, vacxinđơn giá, đại bộphận các nhà sản xuất vacxinlớn trên thế
đã tập trung nghiên cứu và đưa vào sản xuất các loại vacxinđa giá vô hoạt dùng
trong phòng bệnh cho gà. Đểđáp ứng yêu cầu của đợt thực tập tốt nghiệp cuối khóa
tôi tiến hành nghiên cứu đềtài “Nghiên cứu chếtạo vacxinvô hoạt nhũ dầu nhị
giá phòng bệnh Newcastle và viêm phế quản truyền nhiễm ởgà”. Đềtài được
thực hiện tại Bộ môn nghiên cứu Siêu vi trùng, Phân viện Thú y miền Trung - Km
4, Đường 2/4 -Vĩnh Hòa - Nha Trang -Khánh Hòa. Với những nội dung nghiên
cứu sau:
- Giám định một sốđặc tính sinh học của hai giống virus cường độc NDVvà
viêm phếquản truyền nhiễmIBV.
- Kiểm tra tiêu chuẩn giống cường độc Newcastle và IBVđưa vào sản xuất
vacxin. Nhân giống và chuẩn độ02 giống virus trên phôi gà.
- Vô hoạtvà kiểm tra chỉtiêu vô hoạt hai giống virus NDV và IBV.
- Chếtạo vacxin vô hoạt nhũ dầu nhịgiá phòng bệnh Newcastle và viêm phế
quản truyền nhiễm gà với chất bổtrợnhũ dầu.
- Kiểm tra tiêu chuẩn vềvật lý,vô trùng, an toàn và hiệu lực củavacxin.
3
Chương 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Virus Newcastle
1.1.1. Hình thái và các tính trạng lý, hóa
Virus Newcastle là PV-1
(Paramyxovirus-1), thuộc chi Rubulavirus,
tộc Paramyxovirinae, họ
Paramyxoviridae[3].
Đây là virus ARN 1 sợi âm có vỏ
bọc.
Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tửthấy
virion có đườngkính 120 -300 nm, thường
có dạng hình cầu hoặc hình que, hình sợi.
Vỏbọc có độdày khoảng 10 nm. Trên bề
mặt có hai loại gai (Spike) glycoprotein sắp xếp chặt chẽ.
Do không bền vững, khi bịlàm đông giá và tan giá hay khi được tinh vỏbọc
ngoài thườngbịphá hủy dễdàng, nên dưới kính hiển vi điện tửthường thấy
nucleocapsid trần. Nucleocapsid đối xứng xoắn dạng sợi thừng có chiều rộng 14 -18 nm, chiều dài khoảng 1 µm[1]. Virus có thểqua được màng lọc Berkerfeld,
Chamberland và màng lọc Seiz. Virus gây ngưng kết hồng cầu gà, bò, vịt, chuột
bạch, chuột lang và nhóm máu O của người nhưng không gây ngưng kết ởngựa,
lừa, la, thỏ[2].
1.1.2. Cấu trúc hệ gen
Genom virus là RNA 1 sợi âm đơn nhất. Phân tửlượng khoảng 5 -7 MDa,
kích thước khoảng 15 kb và hệgenchiếm 0,5% trọng lượng virion. Hằng sốsa lắng
khoảng 50S -57 S[3].
Hầu hết virus gây bệnh Newcastle cho gia cầm có trình tự
112
R/K-R-Q-K/R-R
116
ởphần cuối C của F2 protein và F (phenylalanine) ởphần còn lại 117, N -phần
[12]
4
cuối của protein F1, trong khi virus có độc lực thấp hơn có trình tự ởphần tương
ứng là
112
G/E-K/R-Q-G/E-R
116
và L (Leucine) ởphần còn lại 117[13].
1.1.3. Protein
Virus có 7 -8 khung phiên mã ( ORF: Open Reading Frame -khung đọc mở:
là đoạn DNA đủdài, không bịchặn bởi bộ ba mã dừng đểmã hóa một polypeptide
có chức năng protein), trên đó miền P được sao mã trùng lặp hay có sựtrùng lặp
gen cho nên có thểphiên dịch được 10 -12 loại protein.
Có 7 loại protein cấu trúc:
 Nucleoprotein (NP): là một protein kiềm kết hợp với RNA tạo thành
nucleocapsid, có tác dụng bảo vệRNA virus.
 Haemagglutinin -neuraminidaza (HN): có đặc tính ngưng kết hồng
cầu gà và có hoạt tính của men neuraminidaza có tác dụng cắt đứt các thụthểhồng
cầu.
 Fusion protein (F, glycoprotein F, protein dunghợp): có hoạt tính
dung hợp màng tếbào và hoạt tính dung huyết. Protein F được tổng hợp ởdạng tiền
thể(protein FO), dưới tác động của enzyme phân giải protein của tếbào ký chủmà
phân cắt thành hai phần là F1 và F2. Nó biểu hiện hoạt tính dung hợp màng và có
hoạt động quan trọng trong việc xâm nhập của virus và hình thành các tếbào khổng
lồđa nhân[4].
 Protein SH (Protein kỵthủy ngắn): chưa rõ chức năng[3].
 Large protein (L): chưa rõ chức năng.
 Matrice protein (M, protein màng): tồn tại mặt trong áo ngoài, có tác
dụng gắn RNA của virus với vỏbọc
 Phospho nucleoprotein: hình ống dài và xoắn ốc nhiều vòng, chưa rõ
chức năng[4].
1.1.4. Sức đềkháng
Do virus có màng bọc ngoài là lipid nên rất dễmẫn cảm với các chất hóa học
như ether, chloroform, cồn, formol, phenol và làm mất khảnăng gây nhiễm nhưng
không ảnh hưởng đến tính miễn dịch của virus. Ởnhiệt độ 56 0C virus bịtiêu diệt


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
[1]. Trần ThịLiên, Nguyễn Hồng Minh, 2008. Nghiên cứu, sản xuất và thửnghiệm
vacxin nhược độc đông khô phòng bệnh viêm phếquản truyền nhiễm ởgà. Tạp chí
KHKT Thú y,3 : 5 - 14.
[2]. Nguyễn Vĩnh Phước, HồĐình Chúc, Nguyễn Văn Hanh và Đặng ThếVinh
(1978). Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội,
trang 387 -398; 421 -425.
[3]. Phạm Hồng Sơn, Phan Văn Chinh, Nguyễn ThịThanh, Phạm Quang Trung
(2002). Giáo trình vi sinh vật học thú y.Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, trang
118 -141; 179 -182.
[4]. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần ThịLan Hương (1997). Giáo trình
vi sinh vật thú y.Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, trang 227 -240.
[5]. Trần ThịLan Hương, 2001: Một sốyếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch
chống bệnh Newcastle của đàn gà công nghiệp. Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp. Hà
Nội -2001.
Tiếng Anh
[6]. Abreu J. T et al. (2010). Molecular studies of the Brazilian infectious bronchitis
virus isolates.Rev. Bras. Cienc. Avic., Campinas, v. 12, n. 2.
[7]. Alexander D. J: (2003). Newcastle disease. In Saif Y. M. Et al (editors).
Disease of poultry. 11
th
edition. Iowa. State Press/A Blackwell Publishing company,
pp 64 -87.
[8]. Cavanagh D. And Naqi S. A (1997). Diseases of poultry, 10
th
ed., Mosby-Wolfe, London, pp:511 -526; 541 - 569.
[9]. OIE TerrestrialManual 2009: Newcastle Disease.Chapter 2.3.14:576-589
62
[10]. Thayer, S.G., Nersessian, B.N., Rivetz, B. And Fletcher, O. J. 1987:
Comparision of serological tests for antibodies agaisnt Newcastle disease virus and
infectious bronchitis virus using Immunocomb solid -phase immunoassay, and the
hemagglutination -inhibition assay.Avian Dieseases 31:459 -463.
[11]. Asean standard requirements for Infectious Bronchitis vaccine, Inactivatedin
Asean standards for animal vaccines, second edition. Livestock Publication Series
No.2A, p.20 -21. http://www.aseansec.org/agr_pub/ls2.doc.
Website
[12]. http://avian-influenza.cirad.fr/research/virology
[13].http://www.cfsph.iastate.edu/HPAI/resources/Additional%20Resources/OIEM
anual2_1_15.pdf
[14]. http://www.infectious-bronchitis.com/ibv-protein-structure.asp
[15].http://www.oie.int/international-standard-setting/terrestrial-manual/access-online/