Thạc Sĩ Nghiên cứu các điều kiện tối ưu trong quá trình sinh tổng hợp enzyme glucoamylase từ một số chủng nấ

MỞ ĐẦU

Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật trên thế giới đã được tiến hành ở mức độ công nghiệp, với qui mô lớn – hàng nghìn tấn mỗi năm, sản phẩm thu được là các chế phẩm enzyme khác nhau, ở dạng thô dùng cho chăn nuôi, và các ngành công nghiệp dệt, thuộc da, hoặc dạng tinh khiết cho thực phẩm, y dược học. Nhật là một trong những nước đi đầu trong lĩnh vực này với hơn 20 công ty sản xuất chế phẩm enzyme. Hàng năm Nhật sản xuất 9850 tấn amylase, 8906 tấn protease, 2200 tấn glucoamylase, 100 tấn lipase, 200 tấn các enzyme khác Ở các nước phát triển như Đức, Hungary, Pháp, Anh, Đan Mạch, v.v ngành công nghiệp sản xuất enzyme cũng được chú ý và phát triển khá mạnh. Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác. Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase gồm các loại a-amylase, b-amylase, g-amylase hay glucosamylase, oligo-1,6- glucosidase, transglucosyldase. Trong đó glucoamylase được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm.
Hiện nay GA là một enzyme chiếm vị trí hàng đầu trong sản xuất công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp lương thực thực phẩm và dược phẩm. Do khả năng thủy phân triệt để, sản phẩm cuối của phản ứng xúc tác chủ yếu là a-glucose, nên GA được sử dụng trong quy trình sản xuất a-glucose. Glucose có thể được dùng bổ sung vào một số dược phẩm, hay làm cơ chất cho công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến thực phẩm. Sử dụng GA trong sản xuất rượu bia giúp thay thế một lượng lớn malt bằng các loại tinh bột khác rẻ tiền hơn như bột gạo, bột mì giúp giảm bớt chi phí sản xuất và giảm giá thành sản phẩm, nhất là đối với những nước phải nhập khẩu nguồn malt nguyên liệu như Việt Nam.
Tuy nhiên, cho đến nay ngành công nghệ enzyme của Việt Nam chưa được phát triển mạnh, lượng enzyme sử dụng đa phần phụ thuộc vào nguồn nhập khẩu. Do đó việc nghiên cứu, tìm hiểu, phát triển sản xuất enzyme nói chung và GA nói riêng có ý nghĩa thực tế quan trọng. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu các điều kiện tối ưu trong quá trình sinh tổng hợp enzyme glucoamylase từ một số chủng nấm mốc và ứng dụng”, tập trung vào các nội dung chính sau đây:
- Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu để đạt hiệu suất thu nhận enzyme GA cao nhất từ 3 chủng nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Rhizopus sp.
- Thu nhận CPE GA từ các canh trường.
- Xác định điều kiện hoạt động tối ưu của CPE.
- Bước đầu ứng dụng CPE để thủy phân tinh bột tạo dung dịch glucose để nuôi nấm men thu sinh khối giàu protein.
MỤC LỤC

Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng biểu
Danh mục các hình, biểu đồ, đồ thị
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ ENZYME . 3
1.1.1. Bản chất sinh học của enzyme 3
1.1.2. Cấu trúc phân tử enzyme 4
1.1.3. Cơ chế xúc tác của enzyme . 5
1.1.4. Tính chất ưu việt của enzyme so với các chất xúc tác khác . 6
1.1.5. Công nghệ enzyme và ứng dụng 7
1.2. ENZYME GLUCOAMYLASE 10
1.2.1. Giới thiệu chung . 10
1.2.2. Cơ chế tác động 10
1.2.3. Tính chất của glucoamylase . 11
1.2.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước
. . 13
1.2.5. Ứng dụng của enzyme glucoamylase . 13
1.2.6. Đặc điểm các chủng nấm mốc tổng hợp glucoamylase . 14
1.2.6.1. Aspergillus . 14
1.2.6.2. Rhizopus 15
1.3. PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VÀ THU NHẬN ENZYME TỪ VI SINH VẬT 16
1.3.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt 16
1.3.1.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường bán rắn 16
1.3.1.2. Phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng . 17
1.3.2.Phương pháp nuôi cấy chìm 17
1.3.3.Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme 17
1.3.3.1. Chủng giống vi sinh vật . 18
1.3.3.2. Môi trường dinh dưỡng . 18
1.3.3.3. Nhiệt độ . 19
1.3.3.4. Độ ẩm 19
1.3.3.5. pH 19
1.3.3.6. Cung cấp oxy . 19
1.3.4. Thu nhận enzyme từ canh trường nuôi cấy 20
1.3.5. Phương pháp tinh sạch enzyme 21
1.3.5.1. Kết tủa enzyme dựa trên tính hoà tan 21
1.3.5.2. Tủa bằng muối . 21
1.3.5.3. Tủa bằng dung môi hữu cơ 21
1.3.5.4. Tủa bằng điểm đẳng điện 21
1.3.5.5. Tủa bằng vật liệu polymer không ion 22
1.3.5.6. Tủa bằng ion kim loại . 22
1.4. NẤM MEN VÀ NUÔI CẤY NẤM MEN THU SINH KHỐI GIÀU PROTEIN 22
1.4.1. Nấm men . 22
1.4.2. Các chất dinh dưỡng cho nấm men 24
1.4.2.1. Dinh dưỡng Carbon 24
1.4.2.2. Dinh dưỡng nitơ 26
1.4.2.3. Dinh dưỡng khoáng . 26
1.4.2.4. Dinh dưỡng các chất sinh trưởng 28
1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng dến hoạt động sống của nấm men 28
1.4.3.1. Nhiệt độ . 28
1.4.3.2. pH của môi trường . 28
1.4.3.3. Thành phần môi trường . 29
1.4.3.4. Oxy hòa tan 29
1.4.4 Ý nghĩa của việc sản xuất và ứng dụng của sinh khối nấm men . 30
1.4.4.1. Ý nghĩa của việc sản xuất sinh khối nấm men [48] 30
1.4.4.1. Ứng dụng của sinh khối nấm men .31
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP . 32
2.1. VẬT LIỆU: 32
2.1.1. Chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu 32
2.1.2. Nguyên liệu. 32
2.1.3. Môi trường nuôi cấy nấm mốc . 32
2.1.3.1. Môi trường giữ giống 32
2.1.3.2. Môi trường bán rắn nuôi nấm mốc thu enzyme 32
2.1.4. Môi trường nuôi nấm men 33
2.1.4.1. Môi trường giữ giống 33
2.1.4.2. Môi trường nuôi nấm men thu sinh khối . 33
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 33
2.2.1. Phương pháp xác định pH 33
2.2.2. Phương pháp xác định độ ẩm . 33
2.2.3. Phương pháp xác định lượng đường khử theo Miller 34
2.2.3.1. Nguyên tắc . 34
2.2.3.2. Hoá chất: 34
2.2.3.3. Cách tiến hành . 34
2.2.4. Định lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân bằng acid . 35
2.2.5. Xác định Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl 36
2.2.5.1. Nguyên tắc . 36
2.2.5.2. Cách tiến hành .36
2.2.6. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật . 38
2.2.6.1. Định lượng mật độ tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu 38
2.2.6.2. Định lượng mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang . 39
2.2.7. Phương pháp nuôi vi sinh vật . 39
2.2.7.1. Phương pháp nuôi cấy nấm mốc thu enzyme 39
2.2.7.2. Phương pháp nuôi cấy nấm men thu sinh khối . 40
2.2.8. Phương pháp xác định thời gian thích hợp để thu nhận enzyme glucoamylase có hoạt độ cao nhất 41
2.2.9. Phương pháp tách chiết và thu nhận dung dịch enzyme 41
2.2.9.1. Phương pháp tách chiết và thu nhận dịch enzyme thô 41
2.2.9.2. Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme glucoamylase từ dịch enzyme bởi tác nhân tủa cồn 42
2.2.9.3. Phương pháp tính hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme 42
2.2.10. Phương pháp xác định hoạt độ glucoamylase 43
2.2.11. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford 44
2.2.12. Phương pháp xác định hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme . 46
2.2.13. Phương pháp khảo sát đặc tính enzyme glucoamylase 46
2.2.14. Phương pháp ứng dụng chế phẩm enzyme glucoamylase để thủy phân các loại tinh bột 47
2.2.15. Phương pháp sử dụng phần mềm Microsoft Excel trong xử lý tính toán kết quả . 48
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48
3.1.XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINH BỘT TRONG CÁC NGUYÊN LIỆU LÀM CƠ CHẤT . 49
3.2. KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ ENZYME GLUCOAMYLASE CỦA CANH TRƯỜNG NẤM MỐC TRÊN CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG KHÁC NHAU 49
3.2.1. Hoạt độ enzyme glucoamylase nấm mốc trên môi trường cám gạo 49
3.2.2. Hoạt độ enzyme glucoamylase nấm mốc nuôi trên môi trường bã khoai mì . 51
3.2.3. Khảo sát tỉ lệ phối trộn thích hợp giữa cám gạo và bã khoai mì để làm môi trường nuôi nấm mốc thu nhận enzyme glucoamylase . 53
3.2.3.1. Hoạt độ enzyme glucoamylase của canh trường Asp.awamori . 53
3.2.3.2. Hoạt độ enzyme glucoamylase trong canh trường Asp.niger 54
3.2.3.3. Hoạt độ enzyme glucoamylase của canh trường Rhizopus.sp . 56
3.3. KHẢO SÁT THỜI GIAN NUÔI CẤY THÍCH HỢP ĐỂ THU NHẬN ENZYME GLUCOAMYLASE . 57
3.3.1. Hoạt độ enzyme glucoamylase của canh trường Asp.awamori 57
3.3.2.Hoạt độ enzyme glucoamylase của canh trường Asp.niger 59
3.3.3.Hoạt độ enzyme glucoamylase của canh trường Rhizopus.sp . 61
3.4. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME GLUCOAMYLASE . 63
3.4.1.Thu nhận CPE từ canh trường nuôi cấy Asp.awamori 63
3.4.1.1. Hiệu suất thu nhận CPE từ canh trường nuôi cấy Asp.awamori . 63
3.4.1.2. Hàm lượng protein của CPE thu nhận từ canh trường Asp.awamori . 64
3.4.1.3. Xác định hoạt độ chung, hoạt độ riêng của CPE thu nhận từ canh trường nuôi cấy Asp.awamori 65
3.4.2. Thu nhận CPE từ canh trường nuôi cấy Asp.niger . 65
3.4.2.1.Hiệu suất thu nhận CPE từ canh trường nuôi cấy Asp.niger 66
3.4.2.2. Hàm lượng protein của CPE thu nhận từ canh trường Asp.niger 66
3.4.2.3. Xác định hoạt độ chung, hoạt độ riêng của CPE thu nhận từ canh trường nuôi cấy Asp.niger 67
3.4.3. Thu nhận CPE từ canh trường nuôi cấy Rhizopus.sp . 67
3.4.3.1. Hiệu suất thu nhận CPE thu nhận từ canh trường Rhizopus.sp . 68
3.4.3.2. Hàm lượng protein của CPE thu nhận từ canh trường Rhizopus.sp 68
3.4.3.3. Xác định hoạt độ chung, hoạt độ riêng CPE thu nhận từ canh trường nuôi cấy Rhizopus.sp 69
3.4.4. So sánh hoạt độ của các CPE thu nhận từ các chủng nấm mốc . 70
3.5 KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH ENZYME GLUCOAMYLASE 71
3.5.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme glucoamylase . 71
3.5.1.1. CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Asp.awamori 71
3.5.1.2. CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Asp.niger 72
3.5.1.3. CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Rhizopu.sp 74
3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme glucoamylase . 76
3.5.2.1. CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Asp.awamori 76
3.5.2.2. CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Asp.niger 78
3.5.2.3. CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Rhizopus.sp 80
3.6. BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG CPE THỦY PHÂN TINH BỘT TẠO DUNG DỊCH GLUCOSE ĐỂ NUÔI NẤM MEN THU SINH KHỐI GIÀU PROTEIN 82
3.6.1. Khảo sát sự thủy phân tinh bột của CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Aspergillus niger . 82
3.6.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến sự thủy phân tinh bột . 83
3.6.1.2. Hàm lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân 84
3.6.2. Nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae trên dịch đường sau thủy phân để thu sinh khối giàu protein . 86
3.7.2.1. Khảo sát sự tạo thành sinh khối nấm men . 86
3.6.2.2. Xác định hàm lượng N tổng số và hàm lượng protein thô từ sinh khối nấm men thu được 87
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 89
4.1. KẾT LUẬN . 89
4.2. ĐỀ NGHỊ . 91
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC