Tài liệu nghiên cứu các đặc trưng hóa học và tính chất quang của hạt vàng dạng cầu và ứng dụng trong đánh dấu

ĐỀ TÀI: nghiên cứu các đặc trưng hóa học và tính chất quang của hạt vàng dạng cầu và ứng dụng trong đánh dấu kháng thể đơn dòng đặc hiệu HER2

MỞ ĐẦU
Công nghệ nano đề cập việc nghiên cứu các các thiết bị (device) mà bản thân chúng hoặc các chi tiết cấu thành cơ bản của chúng có kích thước nằm trong vùng từ 1-1000 nm. V́ đây là vùng kích thước của cấu trúc nguyên tử, phân tử và của các cấu trúc sinh học nên công nghệ nano không chỉ c̣n là lĩnh vực của kỹ nghệ và vật lư mà cũng là của hóa học và sinh học. Đặc biệt, các kết quả nghiên cứu của trên một phần tư thế kỷ vừa qua đă chứng tỏ triển vọng tiềm tàng của ứng dụng công nghệ và vật liệu nano cho y học, thể hiện ở chỗ đă h́nh thành một lĩnh vực khoa học liên ngành mới đang được hết sức quan tâm là Nano Y học (Nanomedicine). Một điểm mạnh mà công nghệ nano đem đến cho y học là tớnh bỏm đớch. Y học đ̣i hỏi phát hiện và diệt trừ các u, mụ; cỏc tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus hoặc hiện đại hơn là tác nhân cấp độ phân tử, gen. Phát hiện th́ yêu cầu độ nhạy càng cao, c̣n chữa trị th́ phải giảm thiểu hiệu ứng phụ. Vật liệu hạt kích thước nano có một số đặc tính vật lư thú vị triển vọng ứng dụng lớn cho mục đích chẩn đoán và chữa trị bệnh theo xu hướng mong muốn trờn. Cỏc loại hạt vô cơ này khi được chức năng hóa bề mặt và đánh dấu miễn dịch cũng sẽ tăng độ nhạy của các phân tích chẩn đoán bệnh lên hàng vài bậc với thời gian được rút ngắn.
Hạt nano vàng đă được biết đến từ thời cổ đại về tính chất màu lư thú sử dụng trang trí trong các đồ dùng thuỷ tinh và kính xây dựng. Gần đây, chúng được quan tâm nghiên cứu mạnh v́ một số tính năng đặc biệt có tiềm năng lớn cho việc ứng dụng trong y sinh. Đặc tính ưu việt của các hạt nano vàng là ổn định về cấu trúc, không độc, có khả năng tương hợp sinh học cao và nhất là chúng dễ dàng hoạt hoá để gắn kết với các phân tử sinh học như amino acid, protein, enzyme, DNA và các phân tử thuốc thông qua các chất có chứa nhóm –SH. Với các đặc tính hoá học bề mặt đặc thù này, các nghiên cứu đang tập trung sử dụng hạt nanụ vàng làm tâm mang cho các hệ thống phân phối thuốc nano, ứng dụng cho chẩn đoán và chữa trị một số bệnh như ung thư, đái tháo đường . Bởi vỡ cú độ ổn định lớn, đồng thời có thiết diện hấp thụ rất lớn trong vùng nh́n thấy nhờ vào hiệu ứng cộng hưởng plasmon bề mặt nên hạt vàng được sử dụng làm chất chỉ thị trong sensor chuẩn đoán bệnh nhanh từ những năm 1980. Các protein liên kết trên bề mặt hạt vàng với sức liên kết lớn khi liên kết đúng, tạo sự gắn kết protein-hạt vàng với độ ổn định cao và bền lâu cả trong dạng lỏng và dạng khô. Que thử ung thư sử dụng hạt vàng làm chất chỉ thị đang là vấn đề mới đang được thế giới quan tâm.
Ở nước ta, nhóm nghiên cứu của PGS.TS. Lê Quang Huấn - Viện Công nghệ Sinh học - Viện KH&CNVN đă sử dụng công nghệ gen để tạo các kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư bằng phương pháp tái tổ hợp phage display (đề tài nhà nước 2006-2008) nhằm tạo các KIT chẩn đoán nhanh cũng như tạo nguồn nguyên liệu cho chế phẩm điều trị một số dạng ung thư bằng liệu pháp kháng thể phage, trong đó có ung thư vú. Để điều trị ung thư vú có hiệu quả th́ việc xây dựng phương pháp định tính và định lượng chính xác hàm lượng kháng nguyên tự do HER2 trong huyết thanh đóng vai tṛ then chốt, mang tính quyết định đối với hiệu quả của các phương pháp điều trị.
Nhằm tham gia phát triển việc sử dụng các hạt nano phát quang trong y - sinh, nhóm nghiên cứu của Viện Vật lư đă đặt vấn đề nghiên cứu chế tạo hạt nano vàng làm chất đánh dấu phát hiện kháng nguyên ung thư vú HER2 nhằm ứng dụng xây dựng kit chẩn đoán bệnh nhanh.
Khâu đầu tiên là phải chế tạo và gắn kết hạt vàng với kháng thể phage kháng HER2 hay c̣n gọi là kháng thể phage đặc hiệu HER2. Nghiên cứu việc gắn kết hạt vàng với kháng thể đặc hiệu, sau đó nghiên cứu tương tác của phức hệ kháng thể - hạt nano liên kết đặc hiệu với kháng nguyên tự do HER2 trong huyết thanh.
Luận văn tŕnh bày các kết quả chế tạo và nghiên cứu các đặc trưng h́nh thái, cấu trúc hóa học và tính chất quang của hạt vàng dạng cầu và ứng dụng trong đánh dấu kháng thể đơn ḍng đặc hiệu HER2 được chế tạo tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH & CNVN.

Luận văn gồm 3 chương:
Chương I: Tổng quan
Chương II: Các phương pháp thực nghiệm
Chương III: Kết quả và thảo luận





CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Các hạt keo vàng (Colloidal Gold)
Các hạt keo vàng là các hạt cú kớch thước cỡ dưới micromet lơ lửng trong chất lỏng.

[TABLE]
[TR]
[TD][/TD]
[/TR]
[TR]
[TD][/TD]
[TD][/TD]
[/TR]
[/TABLE]

Lịch sử hạt keo vàng bắt đầu từ khoảng thế kỷ thứ IV sau công nguyên. Người ta đă t́m thấy các hạt keo vàng trong các cốc Lamó Lycurgus và nhận thấy màu sắc cốc thay đổi theo cách quan sát [13]

H́nh 1.1. Màu sắc của cốc có thể là xanh lục hoặc đỏ khi nh́n ánh sáng
phản xạ trên cốc hoặc nh́n ánh sáng đi từ bên trong xuyên qua thành cốc
Sau thời kỳ đó có thể t́m thấy nhiều ứng dụng khác của các hạt keo vàng: trong các kính màu của nhà thờ, màu men của bát đĩa sứ , thuốc chữa bệnh, . Các nhà giả kim học có thể ḥa tan được vàng khối vào các chất khác để tạo ra các “chất lỏng mầu nhiệm” với các màu sắc khác nhau. Nhờ vào các màu sắc sặc sỡ của dung dịch vàng, tùy thuộc vào h́nh dạng và kích thước hạt, người ta có thể ra các dung dịch với màu sắc khác nhau theo ư muốn bằng cách khống chế h́nh dạng và kích thước hạt.

















H́nh 1.2. Các phép phân tích ngày nay cho thấy trong các cốc Lycurgus cũng như trong các ứng dụng khỏc, cú cỏc hạt nano vàng, bạc và mầu sắc cỳa chỳng phụ thuộc vào h́nh dạng và kích thước của các hạt nano này
Nhưng chỉ đến khi Faraday chế tạo được các hạt vàng (1857) và nhận ra rằng kích thước hạt quyết định màu sắc dung dịch chứa vàng, th́ bản chất của các mầu sắc đó mới được làm sáng tỏ. Năm 1897, Richard Zsigmondy một nhà hóa học người Đức đă chứng minh được rằng màu đỏ tía của men sứ (thường gọi là màu Cassius) là sự kết hợp của hạt keo vàng và axit Stannic. Nhờ phát minh này ông đă được giải Nobel. Tuy nhiên, sự đổi màu của dung dịch chứa vàng chỉ thực sự được làm sáng tỏ vào năm 1908 bởi nhà khoa học Đức Gustav Mie, qua lời giải dựa trên phương tŕnh sóng điện từ Maxwell cho bài toán về sự hấp thụ và tán xạ của súng trờn bề mặt của các hạt h́nh cầu.
1.2. Cộng hưởng plasmon bề mặt (Surface plasmon resonance (SPR))
1.2.1. Định nghĩa
Plasmon: dao động tập thể của các điện tử tự do
Plasmon bề mặt (Surface plasmon): dao động của điện tử tự do ở bề mặt của hạt nano với sự kích thích của ánh sáng tới
Cộng hưởng plasmon bề mặt (Surface plasmon resonance, SPR): cộng hưởng plasmon bề mặt là sự kích thích tập thể đồng thời của tất cả các điện tử “tự do” trong vùng dẫn tới một dao động đồng pha (h́nh 1.3)

H́nh 1.3. Sự tạo thành dao động plasmon bề mặt
Đối với các hạt có kích thước nhỏ, hiệu ứng SPR không lớn do hấp thụ không mạnh. Đối với các hạt to hơn có kích thước vài chục nm, khi kích thước của chúng c̣n nhỏ so với bước sóng ánh sáng th́ ánh sáng nh́n thấy có thể kích thích được SPR. Đối với cùng những hạt đó, năng lượng của plasmon khối rất lớn (6-9 eV). Rơ ràng rằng bề mặt các hạt nano đóng vai tṛ rất quan trọng trong việc quan sát SPR vỡ nú thay đổi các điều kiện biên cho khả năng phân cực của kim loại và do đó dịch tần số cộng hưởng về tần số quang học.

[TABLE]
[TR]
[TD][/TD]
[/TR]
[TR]
[TD][/TD]
[TD][/TD]
[/TR]
[/TABLE]

H́nh 1.3 minh họa sự tạo thành của dao động plasmon bề mặt. Điện trường của sóng ánh sáng tới tạo nên phân cực của các điện tử dẫn (điện tử tự do) đối với lơi ion nặng của một hạt nano cầu. Sự chênh lệch điện tích thực tế ở cỏc biờn của hạt nano về phần ḿnh hoạt động như lực hồi phục (restoring force). Bằng cách đó, một dao động lưỡng cực của các điện tử với chu kỳ T đă được tạo nên.
H́nh 1.4. Sự hấp thụ hệ plasmon bề mặt của các hạt vàng nano cầu có kích thước khác nhau
H́nh 1.4 biễu diễn phổ hấp thụ của SPR của các hạt vàng kích thước 22 nm, 48 nm và 99 nm được chế tạo bằng phương pháp khử muối natri. Hệ số tắt mol [17, 28] (molar extinction coefficient) là cỡ 10[SUP]9[/SUP] M[SUP]-1[/SUP]cm[SUP]-1[/SUP] đối với hạt 20 nm và tăng tuyến tính với thể tích của hạt. Với là thiết diện tương tác (được hiểu như diện tích),N[SUB]A[/SUB] là số Avogardro. Lưu ư là hệ số tắt của các hạt nano là 3-4 bậc cao hơn của cỏc tơm mầu hữu cơ thường được coi là có hệ số tắt rất lớn. Từ h́nh 1.4 có thể thấy là hấp thụ SPR dịch về phía sóng dài khi kích thước hạt tăng c̣n độ rộng phổ tăng khi kích thước hạt bắt đầu lớn hơn 20 nm.
1.2.2. Lư thuyết Mie
Lư thuyết Mie giải thích mầu đỏ của dung dịch hạt nano vàng bằng cách giải phương tŕnh Maxwell cho một sóng điện từ tương tác với một quả cầu nhỏ, có hằng số điện môi phụ thuộc vào tần số giống như vật liệu khối.
Đối với các hạt nanụ kim loại cú kớch thước d nhỏ hơn nhiều bước sóng ánh sáng tới (, hoặc một các gần đúng ) th́ dao động của điện tử được coi là dao động lưỡng cực và thiết diện tắt được viết dưới dạng đơn giản:
(1.1)
Cũng từ lư thuyết Mie ta có thể tính được thiết diện tán xạ C[SUB]sca[/SUB] và thiết diện hấp thụ với các hạt cầu nhỏ biểu diễn dưới dạng:
(1.2)
Trong đó V là thể tích của hạt, là tần số của ánh sáng tới, c vận tốc ánh sáng, k là số sóng, và là hàm điện môi của môi trường bao quanh và của vật liệu hạt. Đầu tiên ta giả thiết là biểu thức độc lập với tần số và là một hàm phức phụ thuộc vào năng lượng, điều kiện cộng hưởng được thỏa măn khi nếu như nhỏ hoặc phụ thuộc yếu vào. Phương trỡnh trờn đó được sử dụng để giải thích tổng quát phổ hấp thụ của hạt nano kim loại nhỏ một cách định tính cũng như định lượng. Ngoài ra người ta c̣n sử dụng mối liên hệ giữa thiết diện tán xạ (thiết diện dập tắt, thiết diện hấp thụ ) với hiệu suất tán xạ (hiệu suất dập tắt , hiệu suất hấp thụ ) plasmon bề mặt theo các biểu thức [28]:
, , (1.3)
Trong đó S là diện tích tương ứng (với hạt cầu , là bán kính hạt cầu)
Tuy nhiên đối với các hạt nano lớn hơn (lớn hơn khoảng 20 nm trong trường hợp của vàng) khi đó gần đúng lưỡng cực không c̣n hợp lệ, cộng hưởng plasmon bề mặt phụ thuộc rơ ràng vào kích thước của hạt r. Kích thước hạt càng lớn thỡ cỏc mode dao động càng cao hơn do ánh sáng lúc đó không c̣n phân cực hạt một cách đồng nhất được nữa. Các mode dao động cao này có vị trí đỉnh phổ ở năng lượng thấp hơn và do đó tần số dao động của plasmon bề mặt cũng giảm khi kích thước hạt tăng. Điều này được mô tả thực nghiệm như trong h́nh 1.4 và cũng tuân theo lư thuyết Mie. Phổ hấp thụ quang phụ thuộc trực tiếp vào kích thước hạt được coi như các hiệu ứng ngoài.
Lư thuyết Mie chứng minh rằng hệ số tắt không phụ thuộc vào kích thước hạt đối với trường hợp các hạt có kích thước nhỏ hơn 20 nm.
Hầu hết các lư thuyết đưa ra đều giả thiết rằng hằng số điện môi của hạt phụ thuộc vào kích thước ε(ω, r) với các hạt có đường kính trung b́nh nhỏ hơn 20 nm. Kreibig và Von Fragstein đề xướng tán xạ điện tử trên bề mặt tăng lên đối với các hạt nhỏ khi mà quăng đường tự do trung b́nh của điện tử dẫn bị giới hạn bởi kích thước vật lư của hạt. Quăng đường tự do trung b́nh của điện tử trong hạt vàng và bạc lần lượt là 40 và 50 nm. Nếu các điện tử va chạm đàn hồi với bề mặt hoàn toàn ngẫu nhiên, sự đồng pha dao động ngẫu nhiên bị mất. Sự va chạm không đàn hồi với điện tử với bề mặt cũng làm thay đổi pha.
Hạt càng nhỏ thỡ cỏc điện tử chạm tới bề mặt của hạt càng nhanh. Điện tử sau đó có thể tán xạ trên bề mặt và mất tính đồng pha nhanh hơn là trong hạt cú kớch thước lớn hơn. Do đó, độ rộng phổ plasmon tăng khi bán kính của hạt giảm. Drude đă đưa ra công thức diễn tả sự phụ thuộc của hằng số điện môi vào kích thước hạt e[SUB]D[/SUB]:
(1.4)
Trong đó là tần số của plasmon khối trong ngôn ngữ mật độ điện tử tự do n và điện tích e, là hằng số điện môi trong chân không và là khối lượng điện tử hiệu dụng. là hàm của bán kính hạt r như sau:
(1.5)
Trong đó g[SUB]0[/SUB] là hằng số tắt của vật liệu khối, A là một tham số phụ thuộc vào chi tiết các quá tŕnh tán xạ (tức là tán xạ đẳng hướng hoặc tán xạ khuyếch tán) và là vận tốc của điện tử có năng lượng bằng mức Fermi.
Mô h́nh này hiệu chỉnh sự phụ thuộc 1/r của độ rộng phổ plasmon như hàm của kích thước cho các hạt nano được diễn tả bằng gần đúng lưỡng cực trong vùng kích thước nội “intrinsic” (r <20 nm). Thông số A được sử dụng như một thông số “làm khớp các giá trị thực nghiệm”. Ưu điểm lớn nhất của lư thuyết này là đă đưa ra một mô h́nh mô tả sự phụ thuộc của hằng số điện môi của hạt vào kích thước.
Cho tới hiện nay sự phụ thuộc đỉnh hấp thụ SPR của hạt vàng kích thước nhỏ r < 20 nm là phức tạp và hạt vàng càng nhỏ th́ đỉnh hấp thụ SPR càng phụ thuộc vào môi trường bao quanh chúng. Đơy cũng là một lợi thế ứng dụng.
1.2.3. Sự phụ thuộc các tính chất quang vào h́nh dạng hạt (lư thuyết Gans)
Phổ hấp thụ SPR của các hạt vàng tách làm hai vùng khi các hạt trở nên dài hơn về một trục. Tỷ lệ tương quan R () là giá trị của trục dài (độ dài) chia cho trục ngắn (độ rộng) của hạt h́nh trụ hoặc dạng que. Khi tỷ lệ tương quan tăng, khoảng cách năng lượng giữa các đỉnh cộng hưởng của hai dải plasmon tăng. Dải năng lượng cao nằm xung quanh 520 nm tương ứng với dao động của các điện tử vuông góc với trục chính (trục dài) và được gọi là hấp thụ plasmon ngang. Dải plasmon đó giữ không đổi với tỷ lệ tương quan (AR) và trùng với SPR của chấm nano. C̣n dải hấp thụ ở năng lượng thấp là của các dao động của điện tử dọc theo trục chính (dài) và được gọi là hấp thụ SPR dọc h́nh 1.5. H́nh vẽ 1.5 chỉ ra phổ hấp thụ của hai thanh nano vàng với các tỷ lệ tương quan là 2,7 và 3,3. Cũng từ phổ đó cho thấy rằng; cực đại dải plasmon theo trục dài (ṿng tṛn) dịch đỏ khi tăng tỷ lệ tương quan R, trong khi đó cực đại dải plasmon theo trục ngang (ô vuông) không thay đổi.

[TABLE]
[TR]
[TD][/TD]
[/TR]
[TR]
[TD][/TD]
[TD][/TD]
[/TR]
[/TABLE]

H́nh 1.5. Sự phụ thuộc phổ hấp thụ plasmon bề mặt vào kích thước của thanh nano vàng với các tỷ lệ tương quan: R = 2,7 ; R = 3,3
Phổ hấp thụ quang học của một tập hợp các thanh nano vàng định hướng ngẫu nhiên với tỷ lệ tương quan R có thể được mô h́nh hóa bằng cách sử dụng sự mở rộng của lư thuyết Mie.
Phổ hấp thụ của các thanh nano vàng (Au nanorod) với tỷ lệ tương quan R được Gans tính toán dựa trên cơ sở lư thuyết Mie với gần đúng lưỡng cực [25]. Thiết diện dập tắt cho h́nh thon dài elip được biểu diễn bởi phương tŕnh:
(1.6)
Trong đó là các thừa số khử cực dọc theo ba trục A, B và C của thanh nano, với , được xác định khi
(1.7)
(1.8)
Và tỷ lệ tương quan R có mối liên hệ như sau
(1.9)
1.3. Các đặc trưng quang học
Plasmons bề mặt chỉ tồn tại ở bề mặt phân cách của hai môi trường với các hằng số điện môi trái dấu. Điều kiện này phù hợp cho ánh sáng vùng hồng ngoại-nhỡn thấy ở mặt phân cách của khụng khớ/kim loại và nước/kim loại (ở đó hằng số điện môi của kim loại có giá trị âm và của nước và không khí có giá trị dương) .