Thạc Sĩ Nghiên cứu bổ sung chitosan oligomer trong nuôi cấy mô khoai lang cao sản nhật bản (ipomoea batatas

MỤC LỤC
Trang
Các chữ viết tắt i
Danh mục ảnh ii
Danh mục bảng iv
Danh mục hình .v
MỞ ĐẦU .1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3
1.1. Tổng quan về cây khoai lang .3
1.1.1 Đặc điểm sinh học 3
1.1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất cây khoai lang .7
1.1.3. Nghiên cứu ngoài nước về cây khoai lang 8
1.1.4Nghiên cứu trong nước về cây khoai lang 9
1.2. Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật 12
1.2.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 12
1.2.2 Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô .14
1.2.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .15
1.2.4 Các bước nhân giống invitro 15
1.2.5. Khử trùng mẫu nuôi cấy .15
1.2.6. Mẫu cấy .17
1.2.7. Môi trường nuôi cấy tế bào thực vật 18
1.2.8. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 19
1.3. Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 25
1.4 Sự phát sinh hình thái 26
1.5. Tổng quan tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam 28 iv
1.6. Tổng quan về Chitosan .29
1.6.1. Công thức cấu tạo 29
1.6.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chitosan .31
CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40
2.1. Nội dung nghiên cứu .40
2.2. Phương pháp nghiên cứu 40
2.2.1. Vật liệu, hóa chất .40
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu .41
2.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các hóa chất khử trùng đến
sức sống của mô nuôi cấy 41
2.2.2.2. Nghiên cứu thành phần môi trường đến sự hình thành
protocorm .44
2.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và loại chất điều hòa
sinh trưởng thực vật lên sự bật chồi và tăng trưởng chồi từ đốt
thân khoai lang in vitro 46
2.2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và loại chất điều hòa
sinh trưởng thực vật lên sự tạo rễ và tăng trưởng chồi cây khoai
lang in vitro 48
2.2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chitosan oligomer
đến sinh trưởng và khả năng kháng bệnh của khoai lang nuôi cấy
mô 50
2.2.2.6 Xử lý số liệu thống kê .52
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .53
3.1. Ảnh hưởng của các hóa chất khử trùng đến sức sống của chồi mầm
từ củ khoai lang 53
3.1.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl 2 đến sức sống của
chồi mầm từ củ khoai lang 53 v
3.1.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các
nồng độ và thời gian khác nhau đến sức sống của chồi mầm từ củ
khoai lang . 57
3.1.3 Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng
độ và thời gian khác nhau đến sức sống của chồi mầm từ củ
khoai lang .69
3.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hình thành protocorm
.62
3.3. Ảnh hưởng của nồng độ, tỷ lệ chất kích thích sinh trưởng đến hình
thành chồi và rễ cây con trong in vitro .65
3.3.1. Ảnh hưởng của N 6 - benzyladenine (BA) và Kinetin ở các
nồng độ và tỷ lệ khác nhau đến sự hình thành chồi và tăng trưởng
chồi cây khoai lang 65
3.3.2. Ảnh hưởng của NAA và IBA ở các nồng độ và tỷ lệ khác
nhau đến sự hình thành rễ cây khoai lang 69
3.4. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan oligomer đến sinh trưởng và khả
năng kháng bệnh của khoai lang nuôi cấy mô .75
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 81
KẾT LUẬN .81
ĐỀ NGHỊ .81
TÀI LIỆU THAM KHẢO .82
PHỤ LỤC vi
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ABA Acid abscisic
BA N 6 – benzyladenine
cs cộng sự
CV Coefficient of Variation
GA 3 Gibberellin
MS Murashige và Skoog
NAA Napthalen acetic acid
IAA Idol – 3 – acetic acid
IBA Indol – 3 – btyric acid
TDZ Thidiazuron
JA Jasmonic acid vii
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl 2 ở các nồng độ và thời gian
khác nhau đến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai lang sau 3
tuần nuôi cấy .55
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng độ và
thời gian khác nhau đến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai
lang sau 3 tuần nuôi cấy .59
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng độ và
thời gian khác nhau đến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai
lang sau 3 tuần nuôi cấy .61
Bảng 3.4 . Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hình thành protocorm
sau 40 ngày nuôi cấy 64
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BA và Kinetin lên sự bật chồi và tăng trưởng chồi từ
đốt thân cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy .67
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự hình thành rễ từ chồi cây khoai
lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy 72
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan oligomer đến sinh trưởng của
khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày nuôi cấy 77 viii
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Cơ chế di chuyển hữu cực của auxin 19
Hình 1.2. Cấu trúc của auxin tự nhiên và auxin tổng hợp 19
Hình1. 3. Cấu trúc của một số dạng cytokinin 20
Hình 1.4. Cấu trúc của khung gibbane và sự chuyển đổi GA 4 thành các GA
khác .21
Hình 1.5. Cấu trúc của ABA .22
Hình 1.6. Cấu trúc của ethylen .22
Hình 1.7. Cấu trúc của TDZ .23
Hình 1.8. Chitin (có 4-10 nghìn gốc N-acetyl-glucosamine) .31
Hình 1.9. Chitosan (có 1-4 nghìn gốc glucosamine) 31
Hình 1.10. Olygoglucosamine (có 2- vài chục gốc glucosamine) .31
Hình 1.11. Cơ chế hoạt động của Chitosan 39
Hình 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl 2 đến sức sống của chồi mầm
từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy ở các nồng độ 0.1% (A), 0.3% (B),
0.5% (C) 56
Hình 3.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng độ và
thời gian khác nhau đến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3
tuần nuôi cấy 60
Hình 3.3. Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng độ và
thời gian khác nhau đến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3
tuần nuôi cấy .62
Hình 3.4. Số lá của cây khoai lang khi BA và Kinetin thay đổi ở các nồng độ
và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 68 ix
Hình 3.5. Chiều cao chồi của cây khoai lang khi BA và Kinetin thay đổi ở các
nồng độ và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 68
Hình 3.6. Chiều cao chồi của cây khoai lang khi IBA và NAA thay đổi ở các
nồng độ và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 72
Hình 3.7. Số rễ của cây khoai lang khi IBA và NAA thay đổi ở các nồng độ
và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy .73
Hình 3.8. Ảnh hưởng của IBA và NAA lên chiều cao chồi, số rễ và chiều dài
rễ từ chồi cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy 73
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan oligomer đến chiều cao chồi của
khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày 78
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan oligomer đến khối lượng chồi
tươi và khối lượng chồi khô của khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày.
.78 1
MỞ ĐẦU
Khoai lang (Ipomoea batatas L. (Lam) là cây lương thực quan trọng được
trồng ở nhiều nước Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ la tinh. Khoai lang không
những chỉ có công dụng làm lương thực cho người, thức ăn cho gia súc mà
còn là sản phẩm của các mặt hàng công nghiệp thực phẩm. Người ta có thể
chế biến rượu, cồn, xiro . từ khoai lang. Tinh bột khoai lang còn dùng trong
công nghiệp giấy và hồ sợi. Một số nước trên thế giới dùng khoai lang chế
biến axit xitoric, dextrin, lấy tinh bột dùng trong y học. Khoai lang chứa nhiều
men amilaza biến tinh bột thành đường mạch nha nên là nguồn nguyên liệu
tốt cho công nghiệp sản xuất loại men này.
Theo thống kê 2006 của Sở Nông Nghiệp – PTNT Đăk Nông và Đăk
Lăk, khoai lang cao sản xuất khẩu đang phát triển mạnh với diện tích ở tỉnh
Đăk Nông là 4500 ha, Đăk Lăk là trên 3000 ha. Trong thời kỳ đầu, năng suất
khoai lang đạt từ 20-25 tấn/ha, giá bán cho suất khẩu là 5 triệu đồng /tấn, đem
lại thu nhập cao cho nông dân. Tuy nhiên, sau 5 năm phát triển năng suất
khoai lang suy giảm gần 40-50%, chỉ còn 12-15 tấn/ha, làm giảm thu nhập
của người nông dân và sản suất không bền vững cả về kinh tế và môi trường.
Chitosan và chitosan oligomer là các chất hoạt hóa một số gen thực vật,
bằng cách tác động trên promoter của trên 20 gen hệ thống đề kháng của thực
vật để tăng cường tổng hợp enzyme chitanase, β- 1,3-glucanase, RNAse,
proteinase inhibitor, tăng cường tổng hợp lignin và kháng sinh thực vật
phytoalexin. Chính vì vậy, Chitosan và chitosan oligomer làm tăng sức đề
kháng của cây với các tác nhân gây bệnh như nấm, vi khuẩn và virus [41].
Chitosan và chitosan oligomer làm tăng khả năng kháng bệnh rỉ sắt
(Phakopspora foiae) của đậu tương (N.A. Dung, 2002) [30]. Suwalee (2002)
công bố phun chitosan cho ngô với nồng độ 100 ppm có khả năng hạn chế
70% bệnh bạc lá[64]. Ngoài ra còn nhiều công bố khẳng định khả năng kháng 2
nấm bệnh của chitosan đối với thực vật, như kháng nấm pythium, Sclerotium,
Fusarium (Hirano, 1996 ; N.A. Dung, 2004, R.D. Park, 2002).
Chitosan oligomer còn được coi là nhóm điều hòa sinh trưởng thực vật thế
hệ mới [68]. Chitosan oligomer có tác dụng kích thích tăng trưởng, tăng hàm
lượng diệp lục, tăng số lượng nốt sần cố định đạm và tăng năng suất của lạc
[33]. Chitosan oligomer làm tăng cường độ quang hợp của lúa, lạc trong thủy
canh [42]. Chitosan oligomer làm tăng chiều dài rễ, kích thước cây con trong
nuôi cấy mô [50].
Với mục đích ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phát triển nông
nghiệp bền vững, vừa tăng năng suất cây trồng, giống không bị thoái hoá,
không sâu bệnh, giảm tỷ lệ nhiễm trong nuôi cấy mô. Chúng tôi đề suất
nghiên cứu đề tài: ‘‘Nghiên cứu bổ sung Chitosan oligomer trong nuôi cấy
mô khoai lang cao sản Nhật Bản (Ipomoea batatas L.).’’
Mục tiêu của đề tài :
ã Xây dựng quy trình nhân giống khoai lang cao sản bằng công nghệ
nuôi cấy mô tế bào trong invitro.
ã Đánh giá hoạt tính kích thích tăng trưởng khi bổ sung chitosan
oligomer trong nuôi cấy mô khoai lang. 3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về cây khoai lang
1.1.1 Đặc điểm sinh học
Vị trí phân loại:
Giới (regnum): Plantae
Ngành (division): Magnoliophyta
Lớp (class): Magnoliopsida
Bộ (ordo): Solonales
Họ(familia): Convolvulaceae
Chi (genu): Ipomoea
Loài (species): Ipomoea batatas L.
Khoai lang trên thế giới chủ yếu được phân bố ở các vùng nhiệt đới,
á nhiệt đới châu Á, châu Phi và châu Mỹ la tinh. Có nguồn gốc từ khu vực
nhiệt đới Châu Mỹ, được con người trồng cách đây khoảng 5000 năm. Nó
được phổ biến rất sớm trong khu vực này, bao gồm cả khu vực Cariber, đã
được biết tới trước khi có sự thám hiểm của người phương tây tới Polinesia.
Ngày nay khoai lang được trồng khắp trong các khu vực nhiệt đới và ôn đới
ẩm với lượng nước đủ để hỗ trợ sự phát triển của cây. Nước ta nằm trong khu
vực nhiệt đới gió mùa, nóng, ẩm, nhiệt độ cao, mưa nhiều, lượng mưa phân
bố tương đối đều nên rất thuận lợi cho cây khoai lang sinh trưởng và phát
triển, do đó có thể trồng quanh năm.
Khoai lang (Ipomoea batatas) là một loài cây nông nghiệp với rễ củ
lớn, chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, được gọi là củ khoai lang và nó là một
nguồn cung cấp rau củ quan trọng, được sử dụng trong vai trò của cả rau lẫn
lương thực. Các lá non và thân non được sử dụng như cũng được sử dụng như 4
một loại rau. Khoai lang có họ hàng xa với khoai tây (Solanum tuberosum) có
nguồn gốc Nam Mỹ.
Là cây thân thảo dạng dây leo sống lâu năm, có các lá mọc so le hình
trái tim hay lá xẻ thùy hình chân vịt, các hoa có tràng hợp và kích thước trung
bình. Rễ củ ăn được, hình dạng thuôn dài và thon, lớp vỏ nhẵn nhụi có màu
đỏ, tía, nâu hay trắng, bên trong củ có màu vàng, trắng, cam, hay tím.
Khoai lang có khối lượng đường bột (cacbonhydrat), vitamin A và năng
lượng cao hơn so với lúa mì, lúa nước, sắn. Khoai lang được sử dụng củ và lá
để làm thức ăn gia súc, chế biến bột, rượu cồn, bánh kẹo và gần đây đang
được nghiên cứu để làm màng phủ sinh học ( bioplastic).
Do đặc điểm tính đa dạng của giống khoai lang, hơn nữa trong quá
trình trồng trọt do chọn lọc tự nhiên, chọn lọc nhân tạo nên đã hình thành
nhiều loại hình, nhiều giống khác nhau.
Khoai lang không chịu được sương giá, phát triển tốt nhất ở nhiệt độ
trung bình khoảng 24 °C (75 °F). Khoai lang ít khi ra hoa nếu khoảng thời
gian ban ngày vượt quá 11 giờ. Chúng được nhân giống chủ yếu bằng các
đoạn thân (dây khoai lang) hay rễ hoặc bằng các rễ bất định mọc ra từ các rễ
củ trong khi lưu giữ bảo quản. Trong các điều kiện tối ưu với 85-90 % độ ẩm
tương đối ở 13-16 °C (55-61 °F), củ khoai lang có thể giữ được trong vòng 6
tháng. Nhiệt độ thấp hoặc cao hơn đều nhanh chóng làm hỏng củ.
Khoai lang phát triển tốt trong nhiều điều kiện về đất, nước và phân bón.
Nó cũng có rất ít kẻ thù tự nhiên nên thuốc trừ dịch hại là ít khi phải dùng tới.
Do nó được nhân giống bằng các đoạn thân nên khoai lang là tương đối dễ
trồng. Do thân phát triển nhanh che lấp và kìm hãm sự phát triển của cỏ dại
nên việc diệt trừ cỏ cũng tiêu tốn ít thời gian hơn. Trong khu vực nhiệt đới,
khoai lang có thể để ở ngoài đồng và thu hoạch khi cần thiết còn tại khu vực
ôn đới thì nó thường được thu hoạch trước khi sương giá bắt đầu. Khoai lang 5
có khả năng thích ứng với nhiều loại đất khác nhau, nhưng sinh trưởng tốt
nhất trên các loại đất thoáng khí như đất thịt nhẹ và đất pha cát. Thời gian
sinh trưởng của cây khoai lang ngắn ngày nhưng lại cho năng suất cao, do đó
cần phải bón nhiều phân và đủ dạng cần thiết. Vì vậy, nói chung điều kiện
khí hậu, thời tiết ở nước ta cho phép trồng khoai lang quanh năm, nhưng cũng
cần lưu ý tới những đặc điểm riêng của từng vùng khí hậu khác nhau để bố trí
thời vụ cho thích hợp. 6
Ảnh 1.1. Cánh đồng trồng khoai lang
Ảnh 1.2. Củ khoai lang cao sản Nhật Bản (Benniazuma) 7
1.1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất cây khoai lang
+ Kỹ thuật nhân giống thông thường:
Khoai lang được nhân giống vô tính bằng chồi củ giống và hom giống
của dây sau khi thu hoạch củ từ vụ trước. Ngoài các yếu tố về đất đai, thời vụ,
phân bón, kỹ thuật canh tác, đặc điểm giống . thì độ dài và chất lượng hom
giống và cách trồng ảnh hưởng rất lớn đến năng suất củ.
Ở Malaysia, người ta trồng hom 6 mắt với độ sâu 2 mắt.
Ở Georgia thường trồng hom khoai lang dài 30 – 40cm với 2 – 3 mắt
dưới đất cho năng suất cao hơn hom giống ngắn 20 – 25cm.
Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau Châu Á (AVRDC) khuyến cáo
trồng hom giống dài 30cm với 3 mắt dưới đất.
Ở Trung Quốc, hom giống 7 mắt được sử dụng phổ biến trong sản
xuất.
Ở Việt Nam, phần lớn các qui trình hướng dẫn đều cho rằng: hom
giống cắt dài 25 – 30cm ở đoạn 1 và đoạn 2 của những dây mập mạnh không
sâu bệnh. Trồng nông nối liền theo chiều dọc luống, mỗi mét dài trồng 5 hom
với khoảng cách từ 18 – 22cm, lấp đất sâu 5 – 6cm.
Công ty thực phẩm Đà Lạt – Nhật Bản (DJF), đơn vị trực tiếp nhập
giống và thu mua khoai lang nhật đã hướng dẫn cách trồng khoai lang nhật
như sau: trồng cây cách cây 25cm, hàng cách hàng 1m, mật độ 25000 cây/ha.
Hom được cắt xong đem về rãi nơi thoáng mát từ 1 đến 2 ngày trước khi
trồng sẽ giúp hom nhanh ra rễ, nảy chồi hơn.