Tiến Sĩ Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà ch

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NĂM 2015
MỞ ĐẦU . 1
1. Tính cấp thiết của đề tài 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu . 2
4. Ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn . 3
4.1. Ý nghĩa lý luận . 3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn 3
5. Đóng góp mới của luận án 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
1.1. PROTEIN NGỌT, PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT VÀ MIRACULIN . 4
1.1.1. Protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt . 4
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ và miraculin 6
1.2. TĂNG CưỜNG SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG
THỰC VẬT . 14
1.2.1. Lựa chọn hệ thống biểu hiện . 14
1.2.2. Lựa chọn promoter (trình tự khởi đầu phiên mã) . 15
1.2.3. Ảnh hưởng terminator đến sự biểu hiện của gen chuyển 20
1.2.4. Thay đổi mã di truyền của gen đích cho phù hợp với hệ thống biểu hiện 20
1.3. NGHIÊN CỨU VỀ CHUYỂN GEN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ
VÀ CÂY CÀ CHUA . 22
1.3.1. Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2) . 22
1.3.2. Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật . 24
1.3.3. Cây cà chua chuyển gen 25
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. VẬT LIỆU . 30
2.1.1. Vật liệu thực vật 30
2.1.2. Vector và chủng vi khuẩn . 30
2.1.3. Hóa chất và thiết bị máy móc 31
2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu . 31
2.2. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.2.1. Thay đổi mã di truyền gen miraculin cho phù hợp với hệ thống biểu hiện ở
cây họ cà 33
2.2.2. Thiết kế mồi 34
2.2.3. Phân lập promoter và terminator . 34
2.2.4. Thiết kế vector chuyển gen mang gen miraculin 38
2.2.5. Phương pháp tạo dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển
gen . 41
2.2.6. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen 43
2.2.7. Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử . 44
2.2.8. Phân tích sự biểu hiện gen trong các dòng chuyển gen 47
2.2.9. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm . 48
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU . 49
3.1. THAY ĐỔI MÃ DI TRUYỀN CỦA GEN MIRACULIN PHÙ HỢP VỚI HỆ
BIỂU HIỆN Ở CÂY HỌ CÀ. PHÂN LẬP PROMOTER E8, PROMOTER VÀ
TERMINATOR HSP 18.2 49
3.1.1. Thay đổi mã di truyền của gen miraculin phù hợp với hệ biểu hiện ở cây
họ cà 49
3.1.2. Phân lập và tách dòng promoter E8 từ cà chua, promoter và terminator
HSP 18.2 từ Arabidopsis . 51
3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MIRACULIN VÀO DÒNG TẾ BÀO
BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA . 58
3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter 58
3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter . 60
3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter . 62
3.2.4. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter 63 3.2.5. Biến nạp vector chuyển gen mang gen miraculin vào Agrobacterium . 65
3.3. BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO
BY2 VÀ HỆ THỐNG RỄ TƠ THUỐC LÁ . 66
3.3.1. Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 . 66
3.3.2. Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong rễ tơ thuốc lá . 71
3.4. BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG CÂY
CÀ CHUA . 79
3.4.1. Tạo dòng cà chua chuyển gen miraculin . 79
3.4.2. Kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong các dòng cà chua bằng
kỹ thuật PCR . 83
3.4.3. Phân tích sự biểu hiện ở mức mRNA của gen miraculin trong một số dòng
cà chua chuyển gen . 84
3.4.4. Xác định số bản copy trong dòng cà chua chuyển gen bằng kỹ thuật
Southern 85
3.4.5. Đánh giá một số chỉ tiêu sinh trưởng của một số dòng cà chua
chuyển gen . 86
Chương 4. THẢO LUẬN 91
4.1. Tăng cường sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong thực vật . 91
4.2. Biểu hiện miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 và rễ tơ thuốc lá . 94
4.3. Biểu hiện miraculin tái tổ hợp trong cây cà chua chuyển gen . 99
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 104
NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 105
SUMMARY 106
1. Overview: 106
2. Objectives: . 107
3. Contents: . 107
4. Results: 107
5. Discussion: 108
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 112
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay, các chất làm ngọt nhân tạo như saccharin, aspartame, sucralose và
acesulfame-K được con người sử dụng phổ biến như những chất làm ngọt ít năng
lượng, nhằm giảm nguy cơ mắc các bệnh mạn tính liên quan đến đường như béo
phì, đái tháo đường. Tuy nhiên, một số hợp chất này có thể gây ung thư (Kant
2005).
Trong tự nhiên, có rất nhiều loại protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt đã
được phát hiện bao gồm thaumatin, monellin, mabinlin, pentadin, brazzein,
neoculin (curculin) và miraculin. Các protein này có thể được sử dụng để thay thế
các chất làm ngọt nhân tạo bởi vì chúng tạo vị ngọt cho người sử dụng, an toàn do
có nguồn gốc tự nhiên và ít sinh năng lượng. Tuy nhiên, sản lượng tự nhiên của các
protein này bị hạn chế do hầu hết các protein này thu được từ cây sống ở vùng nhiệt
đới, nơi có điều kiện khí hậu khắc nghiệt (Kant 2005).
Gần đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu biểu hiện thành công một số
protein ngọt và tạo vị ngọt như thaumatin, monellin, brazzein và miraculin ở quy
mô phòng thí nghiệm trong một số hệ thống biểu hiện như vi khuẩn, nấm men, nấm,
tế bào BY2, hệ thống nuôi cấy rễ tơ và cây trồng chuyển gen (Masuda, Kitabatake
2006, Pham Bich Ngoc 2009). Tuy nhiên, mức độ tích lũy của các protein tái tổ hợp
này khá thấp, dẫn đến các nghiên cứu về protein ngọt và protein tạo vị ngọt đều
chưa thể sản xuất thương mại các sản phẩm tái tổ hợp.
Miraculin là một trong số các protein tạo vị ngọt, có trong quả của cây thần
kỳ (Richadella dulcifica), có đặc tính tạo ra cảm giác ngọt để thay đổi từ vị chua
thành cảm giác ngọt mà bản chất của miraculin là không ngọt. Tính chất độc đáo
này của miraculin rất có ích cho con người nhằm ngăn ngừa các căn bệnh hiện đại
do các chất làm ngọt nhân tạo gây ra. Miraculin cũng là chất ít sinh năng lượng. Do vậy, có thể sử dụng miraculin để thay thế đường, giúp người sử dụng tránh được các
nguy cơ mắc bệnh béo phì. Với tính chất độc đáo như vậy, xong sản lượng của
miraculin trong tự nhiên bị hạn chế do cây thần kỳ sinh trưởng chậm ở nơi khí hậu
khắc nghiệt của Tây Phi.
Gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu nhằm sản xuất miraculin tái tổ hợp
trên một số đối tượng khác nhau. Tuy nhiên, mức độ tích lũy của miraculin tái tổ
hợp trong hệ thống biểu hiện vẫn chưa được như kỳ vọng. Xuất phát từ lý do trên,
chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin
trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển gen”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Thay đổi mã di truyền gen miraculin của cây thần kỳ, thiết kế vector chuyển
gen cùng với các promoter đặc hiệu và promoter cảm ứng để chuyển vào dòng tế
bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua nhằm thu được các dòng chuyển gen có khả
năng biểu hiện miraculin tái tổ hợp.
3. Nội dung nghiên cứu
1) Thay đổi mã di truyền của gen miraculin cho phù hợp với hệ thống biểu hiện
ở cây họ cà. Phân lập, nhân dòng promoter E8 từ cà chua, promoter HSP
18.2 và terminator HSP 18.2 từ Arabidopsis thaliana.
2) Thiết kế vector biểu hiện miraculin trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và
cây cà chua.
3) Biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong dòng tế bào BY2 và rễ tơ thuốc
lá.
4) Biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong cây cà chua.