Tài liệu Nghiên cứu biểu hiện gen Trehalase tái tổ hợp ở E.coli và xác định các tính chất của enzyme

ĐỀ TÀI: Nghiên cứu biểu hiện gen Trehalase tái tổ hợp ở E.coli và xác định các tính chất của enzyme

MỞ ĐẦU

Ngày nay, công nghệ sinh học phân tử đă phát triển nhanh chóng, đạt được những thành tựu to lớn về lư thuyết và thực tiễn. Sự phát triển không ngừng của sinh học phân tử giúp cho con người hiểu biết cơ sở khoa học một số bệnh nan y, t́m ra các loại thuốc giúp cho con người chống lại cỏc bờnh tật và nâng cao sức khỏe đời sống. Thành tựu công nghệ sinh học phân tử ngày càng được ứng dụng rộng rói trong công nghiệp, nông nghiệp đặc biệt là các sản phẩm chức năng.
Xă hội ngày càng phát triển nên vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được quan tâm. Do đó các sản phẩm chức năng không ngừng được cải tiến nâng cao chất lượng. Và khi những thành tựu về y học, hóa sinh học, sinh lư học và dinh dưỡng học được cải tiến th́ những thực phẩm chức năng, thực phẩm điều trị bệnh được sản xuất nhiều hơn.
Ngày nay, thực phẩm chức năng đang được con người đặc biệt quan tâm v́ đây là những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng và mức năng lượng thấp nhưng trong đó có chứa rất nhiều tác dụng. Trong nhóm thực phẩm người ta quan tâm khá nhiều đến đường chức năng. Có rất nhiều loại đường chức năng như: đường Maltitol, đường Fructooligosaccharide, đường Sorbitol, đường Trehalose Trong số đó đường Trehalose là một trong những loại đường có nhiều công dụng đối với cuộc sống con người, đặc biệt đối với những người béo ph́, những người mắc bệnh tiểu đường, sâu răng,
Cùng với sự phát triển của đường chức năng, các loại enzyme ứng dụng trong lĩnh vực này cũng ngày được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng Trehalase là enzyme được sử dụng để sản xuất Trehalose là nhân tố điều chỉnh quá tŕnh đông lạnh, ngăn ngừa quá tŕnh kết tinh, cung cấp giá trị dinh dưỡng. Do vậy nghiên cứu sản xuất Trehalase là enzyme được sử dụng để sản xuất Trehalose là nhu cầu cần thiết. Đặc biệt trên thị trường Việt Nam hiện nay chủ yếu nhập chế phẩm này từ nước ngoài nên giá thành tương đối cao. V́ vậy, việc nghiên cứu sản xuất enzyme Trehalase không chỉ có ư nghĩa khoa học mà c̣n có giá trị kinh tế xă hội.
Từ những lư do trên chúng tôi đă thực hiện đề tài nghiên cứu sau:
“Nghiờn cứu biểu hiện gen Trehalase tái tổ hợp ở E.coli và xác định các tính chất của enzyme”
Mục tiêu của đề tài:
1. Biểu hiện gen Trehalase tái tổ hợp ở E.coli.
2. Tách và tinh chế enzyme.
3. Xác định các đặc tính của enzyme
4. Ứng dụng enzyme để tổng hợp Trehalose.

PHẦN 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I.1 Công nghệ DNA tái tổ hợp
Kỹ thuật di truyền là thuật ngữ chung cho nhiều kỹ thuật cơ bản trong nghiên cứu di truyền phân tử. Thuật ngữ kỹ thuật gen c̣n gọi công nghệ gen hay kỹ thuật gen vấn đề cốt lơi của sinh học hiện đại.
Năm 1983 Rudleg và Sediel: kỹ thuật di truyền là các kỹ thuật dẫn đến khả năng biến đổi định hướng gen, tần số kiểu gen của một quần thể, hoặc làm tăng căn bản khả năng sinh sản của một số cá thể để nâng cao vốn gen và tăng số lượng hợp tử của quần thể. Kỹ thuật gen được bắt đầu năm 1977, bao gồm các thao tác kỹ thuật trên gen, nhằm điều chỉnh và biến đổi gen hoặc tạo ra các gen mới từ đó tạo ra các cá thể mới. Kỹ thuật gen bao gồm một số kỹ thuật cơ bản là kỹ thuật DNA tái tổ hợp, phân lập gen, chuyển ghép gen, dung hợp gen vi thao tác gen.
DNA tái tổ hợp là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử DNA được gộp nối từ các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong loài, hoặc các loài khác nhau gọi DNA tái tổ hợp.
Nguyên tắc chung của công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm một số bước sau. Trước hết genome mục tiêu và DNA chuyển tải (vector) được tinh chế và cắt thành từng đoạn nhờ một loại Enzyme hạn chế. Trong nhiều trường hợp (đặc biệt đối với sinh vật bậc cao) DNA gen nome được thay thế bằng DNA tương bù (cDNA) củ mRNA thành thục. DNA này được tổng hợp từ khuôn RNA thông tin nhờ xúc tác của enzyme sao chép ngược (reverse transcriptase, rna-dependent DNA-polymerase). DNA vector có thể là một plasmid hoặc phage (nếu vật mang ḍng hóa gen là vi khuẩn), plasmid Ti của vi khuẩnAgrobacterrium tumefaciens (nếu vật mang dũng hóa gen là tế bào thực vật), là Vius (retrovirus hoặc andovirus không gây bệnh, nếu vật mang dũng hóa gen là tế bào động vật). Bước thứ hai là chuyển vận DNA tái tổ hợp vào cơ thể vật mang, dũng hóa và bước tiếp sau đó là nuôi cấy vật mang, sản xuất (chiết suất và tinh chế) sản phẩm mục tiêu.
Nhờ được cắt cùng một loại enzyme hạn chế (thường là enzyme đầu dớnh) cỏc đoạn DNA mục tiêu và các đoạn DNA vector (chỉ cắt tại một điểm của mạch ṿng xoắn kép) có thể ngẫu nhiên h́nh thành liên kết hidro tương bù ở các đầu dính, rồi được ligase hàn gắn các đầu khác. Kết quả trong hỗn hợp h́nh thành thể tái tổ hợp của vector với một hoặc một số mảnh DNA của genome mục tiêu (bên cạnh các sản phẩm không mong muốn như vector tự khộp vũng, các vector tự tái tổ hợp với nhau và các mảnh DNA khụng tỏi tổ hợp hoặc tự tái tổ hợp). Tất cả các sản phẩm trong hỗn hợp đều được trộn đều với các vật mang tạo ḍng, sau đó các vật mang được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng có yếu tố chọn lọc (chất kháng sinh đối với vi khuẩn, hóa chất gây chết đối với các tế bào động vật thực vật). Trong điều kiện đó, chỉ các tế bào vật mang vector sống sót. Hơn nữa, do plasmid bị enzyme hạn chế cắt thỏo vũng tại một vị trí xác định trong một gen điều khiển một thuộc tính nhận biết khác, những plasmid đó tỏi tổ hợp mất khả năng tạo tính trạng đó ở vật mang (chẳng hạn, mất khả năng tổng hợp Beta-galactosidase), nên chỉ những vật mang sống sót và không biểu hiện tính trạng đú thỡ được chọn nuôi cấy tạo ḍng. Bước tiếp theo là chọn những ḍng tính trạng của gen mục tiêu hoặc những ḍng gen mục tiêu (nhờ lai phân tử: các phương pháp thử nghiệm miễn dịch như ELISA, Westerm blot anlysis, Northern blot anlysis hoặc với các ḍ DNA hoặc RNA – southern blot anlysis, Norther blot anlysis), hoặc PCR. Nuôi cấy tạo ḍng những cá thể vật mang thỏa măn các bước thử nghiệm trờn giỳp tạo ra ḍng thuần các sinh vật mang có thể sản xuất các sản phẩm mục tiêu.
Thực chất của công nghệ DNA tái tổ hợp là tập hợp nhiều kỹ thuật trên một gen, cải biến cấu trúc của gen, bộ gen tạo ra các gen mới trong bộ gen. Công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm các bước cơ bản sau.
- Tách chiết DNA, RNA (phân lập gen)
- Tạo vector tái tổ hợp (bao gồm chuẩn bị vector tỏch dũng)
- Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhơn dũng.
- Sàng lọc, theo dơi hoạt động và biểu hiện của gen
Cho đến nay, kỹ thuật di truyền đă đạt được những bước tiến vượt bậc. Nhiều sản phẩm có ích đă được sản xuất từ các vi sinh vật tái tổ hợp hay vi sinh vật biến đổi gen (gentically modified organisms – GMO) như giống ngũ cốc đậu tương, hạt có dầu, bụng, mang gen chống sâu bệnh hoặc kháng thuốc chống cỏ dại hoặc có chất lượng sản phẩm nâng cao như khoai tây chứa nhiều Protein, lúa nhiều vitamin A và sắt, Tạo ra được những vacxin tái tổ hợp có thể dễ sản xuất (dễ nuôi cấy trên lứa cấy tế bào hay phôi gà) và dễ sử dụng cho ăn uống, hoặc những động vật tái tổ hợp sản sinh những sản phẩm hữu ích như thuốc chữa bệnh, thậm chí tạo ra những đàn lợn mang kháng nguyên người, hy vọng là vật có thể cho tim hoặc nội tạng khác để điều trị những trường hợp người bệnh cần thay thế nội quan, Tuy nhiên, kỹ thuật di truyền cũng đặt loài người vào t́nh trạng có thể phải đương đầu với những đe dọa mới liên quan tới sức khỏe của người và sinh thái – môi trường. Chưa thể chứng minh được tính vô hại của GMO thực phẩm đối với con người, cũng như chưa phủ nhận khả năng lan truyền gen kháng thuốc (của Plasmid vector) trong tập đoàn các vi khuẩn tự nhiên của cơ thể (ví dụ trong đường ruột) người và động vật. Chăm sóc những loại cây trồng đề kháng thuốc diệt cỏ và thuốc diệt sâu bệnh có thể dẫn đến lạm dụng nông dược và nếu thoái hóa trở thành cỏ dại th́ thực vật kháng thuốc và kháng sâu bệnh sẽ là một nguy cơ mới đối với nông nghiệp. Tương tự, nguy cơ những sinh vật GMO lấn át sinh vật tự nhiên sẽ là rất cao và có thể dẫn đến sự tuyệt diệt của nhiều loài sinh vật hiện có gây hậu quả nghiêm trọng đến môi trường sinh thỏi
I.2 Đại cương về vi khuẩn E.coli
Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1973); Nguyễn Lân Dũng (1976), trực khuẩn Escherchia Coli có tên khoa học là Bacterium Coli Comunis b́nh thường E.coli cư trú ở phần sau của ruột (ruột già và phần cuối của ruột non), ít khi có ở dạ dày hay phía trước ruột non của động vật (Nguyễn Vĩnh Phước,1978). Tỉ lệ E.coli ở kết tràng là 58.3%, trực tràng 55.3%, manh tràng là 39.3% E.coli xuất hiện và sinh sống ở động vật chỉ vài giờ sau khi sinh và tồn tại đến khi con vật chết. Loài ăn tạp và ăn thịt thải nhiều E.coli hơn loài ăn cỏ. Theo Kefman những chủng E.coli thường gặp về huyết thanh được chia thành những Serotype riêng. Trong số này một số serotype đóng vai tṛ quan trọng trong việc gây bệnh cho người và động vật.
I.2.1 Đặc điểm h́nh thái
E.coli là loài trực khuẩn h́nh gậy gắn, hai đầu tṛn, có lông, di động được, không h́nh thành nha bào, giỏp mụ, bắt màu Gram âm, thường thẫm ở hai đầu ở giữa nhạt, kích thước vi khuẩn 2-3 uM x 0.4-0.6 um.Trong cơ thể gia súc, vi khuẩn có h́nh cầu, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn.
I.2.2 Đặc tính nuôi cấy
E.coli là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy tiện, dễ nuôi cấy, có thể sinh trưởng và phát triển thích hợp nhất ở 37[SUP]o[/SUP]C, pH thích hợp là 7.2-7.4. Tuy nhiờn chỳng vẫn có thể phát triển trong môi trường có pH = 5.5-8.0.
Môi trường nước thịt: E.coli phát triển rất nhanh, môi trường đục đều, có lắng cặn xuống đáy màu tro nhạt, trên mặt h́nh thành màng mỏng màu ghi nhạt dính vào thành ống nghiệm, canh trùng có mùi phân thối.
Môi trường thịt thường: nuôi cấy ở 37[SUP]o[/SUP]C trong 24h h́nh thành khuẩn lạc tṛn, ướt hới lối, không trong suốt, màu tro nhạt, đường kính khuẩn lạc khoảng 2-3mm.
Môi trường Endo: h́nh thành khuẩn lạc có ánh kim.
Môi trướng SS: trên môi trường này sau 24h nuôi cấy h́nh thành khuẩn lạc màu hồng nhạt hoặc màu đỏ cánh sen.
Môi trường EMB: E.coli có khuẩn lạc màu tím đen.
Môi trường Macconkey: E.coli h́nh thành khuẩn lạc màu đỏ.
Môi trường Billiant –Green–agar: khuẩn lạc của E.coli có dạng S, màu vàng chanh.


I.2.3.Đặc tính sinh hóa
Các chủng E.coli đều lên men sinh hơi mạnh các loại đường Glucose, Galactose, Lactose, Mannitol
E.coli lên men không sinh hơi các loại đường như Saccarose, Ramnose, Xalixin, Valin, Glyxeron.
Các phản ứng sinh hóa khác:
Phản ứng indol (+), phản ứng VP (=), phản ứng MR (+), phản ứng H2S (+), hoàn nguyên Nitrat thành Nitrit, Urease (-), Gelatin (-).
I.2.4 Sức đề kháng của E.coli
E.coli bị tiêu diệt ở nhiệt độ 55[SUP]o[/SUP]C trong một giờ, 60[SUP]o[/SUP]C trong 30 phút (Willon và Miles, 1995), (Nguyễn vĩnh Phước, 1973). Các chất sát trùng như: Axit phenic, Clorua thủy ngân, Formol có thể tiêu diệt E.coli trong 5 phút.
I.3. T́nh h́nh sản xuất và ứng dụng enzyme trên thế giới và Việt Nam
I.3.1 T́nh h́nh sản xuất và ứng dụng enzyme trên thế giới
Enzyme có vai tṛ vô cùng quan trọng, không chỉ xúc tác cho các phản ứng hóa học xảy ra trong hệ thống sống mà sau khi tách khỏi hệ thống sống chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (intro). Bởi vậy, công nghệ enzyme ngày càng phát triển. Những thành tựu cơ bản về enzyme là cơ sở để phát triển các nghiên cứu ứng dụng enzyme trong thực tiễn.
Enzyme thường được sử dụng theo hai cách: khụng tỏch enzyme ra khỏi nguyên liệu mà tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động của một số enzyme có sẵn trong nguyên liệu để chúng chuyển hóa các chất cú cựng trong nguyên liệu theo hướng mong muốn. Hoặc tách enzyme ra khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm khi cần thiết. Enzyme hoạt động sinh học có thể được tách từ bất kỳ cơ quan sống nào. Ví dụ enzyme thương mại có thể được sản xuất từ Acitinoplanes tới Zymomonas. Từ rau chân vịt (spinach) đến nọc độc của rắn. Do đó có thể tận dụng nguồn nguyên liệu giàu enzyme để tách enzyme, dùng enzyme để chế biến các loại nguyên liệu khác nhau hoặc sử dụng vào những mục đích khác nhau. Hàng trăm enzyme thương mại được sản xuất ra, trong đó hơn một nửa từ nấm mốc và nấm men, quá 1/3 từ vi khuẩn, c̣n lại 8% từ động vật, 4% từ thực vật.
Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu tốt nhất của công nghệ enzyme v́ chỳng cú tốc độ sinh trưởng nhanh trờn cỏc môi trường dinh dưỡng không đắt tiền, không đ̣i hỏi thiết bị đắt tiền, có thể tự động hóa hoặc điều khiển, năng suất cao Hơn nữa, ta có thể chủ động điều khiển quá tŕnh sinh tổng hợp enzyme, nâng cao hàm lượng enzyme trong tế bào vi sinh vật dễ dàng hơn tế bào thực vật và động vật.
Hàng năm, hàng trăm tấn chế phẩm enzyme được sản xuất phục vụ cho ngành công nghiệp và y học. Năm 1980, trên thế giới sản xuất 530 tấn protease từ vi khuẩn, 350 tấn glucoamylase, 320 tấn a – Amylase, 70 tấn glucoisomerase, tất cả trị giá 150 triệu USD.
Hiện nay trên thị trường có khoảng 12 hăng sản xuất enzyme chính với trên 60 nhà cung cấp lớn. Hai hăng sản xuất enzyme lớn nhất hiện nay là Novo Nordisk (Đan Mạch) và Gist Brocades chiếm 60% lượng enzyme trên thị trường. Tiếp đó là Mỹ 15%, trong đó 2/3 sử dụng nội địa chủ yếu dùng để sản xuất cồn và đường nghịch đảo. Năm 1993, trên thị trường Mỹ tiêu thụ 50 triệu USD đối với renin, 27 triệu USD đối với glucoAmylase, 23 triệu USD đối với glucoisomerase Khoảng 50 loại enzyme khác nhau được bỏn trờn thị trường Mỹ. Nhật chiếm 12-15% thị trường tiêu thụ với các sản phẩm đa dạng. Trung Quốc và Nga là hai thị trường sản xuất chủ yếu để phục vụ trong nước.
Đến nay người ta đă biết và phân loại khoảng 3500 loại enzyme, khoảng vài trăm loại được sản xuất trên quy mô công nghiệp chủ yếu là enzyme Amylase, Protease. Lipase
- Amylosidase: sản xuất với sản lượng 5 tấn /năm sử dụng để tách L- acid amin khỏi hỗn hợp DL axit amin (250 tấn L axit amin trên năm)
- Amyloglucosidase: sản lượng 1 tấn /năm, sản xuất 3000 tấn glucose từ tinh bột/năm.
- Glucoisomerase: sử dụng để sản xuất xiroglucose – fructose 42% (2.150.000 tấn /năm) và xiroglucose- fructose 55% (1.450.000 tấn/ năm).
Phần lớn enzyme được sử dụng ở mức độ công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 70% chế phẩm là enzyme thủy phân sử dụng để thủy phân các cơ chất tự nhiên.
Các protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay dùng trong quá tŕnh đông tụ sữa sản xuất fomat, làm mềm thịt, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da. Tiếp đến là các enzyme nhóm Hydaratcacbonat như Amylase, Cellulose, Pectinase Sử dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy.
Trong công nghiệp thực phẩm các chế phẩm enzyme được sử dụng với 4 mục đích chính:
- Điều chỉnh những khiếm khuyết của nguyên liệu. Nguyên liệu của công nghiệp thực phẩm là các sản phẩm phức tạp có nguồn gốc từ động vật và thực vật được h́nh thành qua nhiều giai đoạn tổng hợp sinh học. Do đó, thành phần nguyên liệu phụ thuộc vào các yếu tố bên trong như giống loài và các yếu tố bên ngoài như điều kiện canh tác khí hậu. Các yếu tố này có thể làm thay đổi thành phần nguyên liệu và chuyển hóa nó. Trong trường hợp này các chế phẩm enzyme được sử dụng một phụ gia lấp đầy những thiếu hụt. Trong công nghiệp chế biến đường, tinh bột, bánh mỳ, bia người ta bổ sung Amylase để bù hoạt lực enzym yếu của nguyên liệu ngũ cốc. Trong sản xuất fomat, enzyme lipase và protease được sử dụng thay thế các enzyme từ nguyên liệu sữa bị vô hoạt để thanh trùng.
- Tham gia chuyển hóa, ứng dụng nhiều nhất trong sản xuất bánh bisque, fomat, nước uống protease cho phép cải thiện tính lọc của bia và tính năng ổn định của nó ở nhiệt độ thấp. Amylase, pectinase, hemicellulase tạo điều kiện cho việc tách chiết và lọc nước quả. Protease trung tính làm mềm dẻo khung gluten cải thiện độ nở của bột nhào và độ gịn của bisque.
- Tăng giá trị nguyên liệu tự nhiên. Enzyme có thể tham gia vào việc đa dạng hóa sản phẩm nhận từ nguyên liệu tự nhiên. Sự phát triển của công nghệ enzyme đă cho ra đời một loạt các chế phẩm enzyme cho phép tạo ra nhiều sản phẩm: chất làm đặc, chất thơm, chất tạo ngọt, chất tạo chua việc cải thiện đặc tính của enzyme về tính đặc hiệu và tính chịu nhiệt là cơ sở để sản xuất chế phẩm enzyme mới thích hợp môi trường và đặc hiệu hơn.