Tiến Sĩ Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương .

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NĂM 2013

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC TỪVÀ THUẬT NGỮVIẾT TẮT i
DANH MỤC BẢNG . iii
DANH MỤC HÌNH iv
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI .4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN . 5
1.1. Tếbào gốc và công nghệtếbào gốc 5
1.1.1. Tình hình nghiên cứu tếbào gốc nước ngoài 5
1.1.2. Tình hình nghiên cứu tếbào gốc trong nước . 6
1.1.3. Tếbào gốc . 7
1.1.4. Phân loại tếbào gốc . 10
1.1.5. Tếbào gốc trung mô 14
1.1.5.1. Khái niệm . 14
1.1.5.2. Đặc điểm . 14
1.1.5.3. Tiềm năng biệt hóa của tếbào gốc trung mô 15
1.1.5.4. Các nguồn tếbào gốc trung mô 19
1.2. Ứng dụng của tếbào gốc 21
1.3. Các bệnh vềxương khớp và tếbào gốc trong điều trịcác bệnh vềxương khớp 22
1.4. Dây rốn, tếbào gốc từdây rốn 27
1.4.1. Mô học, giải phẫu và chức năng 27
1.4.2. Tếbào gốc trung mô từmàng bao dây rốn 27
1.4.3. Tếbào gốc từmàng dây rốn và tiềm năng ứng dụng 28

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 32
2.1. Vật liệu nghiên cứu . 32
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu: . 32
2.1.2. Hóa chất và Máy móc thiết bị 32
2.2. Phương pháp nghiên cứu . 34
2.2.1. Phân lập tếbào gốc trung mô từmàng dây rốn người 34
2.2.1.1. Thu thập và bảo quản dây rốn 34
2.2.1.2. Phân lập tếbào gốc trung mô từmàng dây rốn người 34
2.2.1.3. Nuôi cấy tăng sinh tếbào gốc trung mô màng dây rốn 35
2.2.2. Kiểm định sản phẩm tếbào gốc . 35
2.2.2.1. Định danh tếbào gốc bằng dấu ấn bềmặt . 35
2.2.2.2. Kiểm tra tính gốc của tếbào gốc trung mô màng dây rốn . 36
2.2.3. Biệt hóa in vitro tếbào gốc trung mô theo hướng thành tếbào tạo xương 36
2.2.3.1. Khảo sát môi trường cơbản và nồng độchất cảm ứng biệt hóa tếbào gốc trung mô
thành tếbào tạo xương 36
2.2.3.2. Kiểm tra sựtích lũy canxi của tếbào sau biệt hóa bằng nhuộm alizarin red . 38
2.2.3.3. Khảnăng tích tụcanxi của tếbào tạo xương biệt hóa từtếbào gốc trung mô . 38
2.2.3.4. Xác định hoạt tính của Alkaline phosphates (ALP) . 38
2.2.4. Tách chiết RNA và tiến hành phản ứng RT-PCR (Reverse Trancriptase -
Polymerase Chain Reaction) . 39
2.2.5. Phương pháp xác định sốlượng tếbào nuôi cấy 43
2.2.6. Thu hoạch và bảo quản tếbào . 44
2.2.7. Phục hồi tếbào sau bảo quản lạnh sâu 44
2.2.8. Cấy ghép tếbào tạo xương biệt hóa từtếbào gốc trung mô màng dây rốn lên
chuột nhắt đã gây suy giảm miễn dịch bằng hóa chất 45
2.2.8.1. Tạo mô hình chuột nhắt suy giảm miễn dịch 45
2.2.8.2. Cấy ghép tếbào tạo xương biệt hóa từtếbào gốc trung mô màng dây rốn trên
chuột 45
2.3.9. Nhuộm hematoxylin và eosin 46
2.2.10. Phương pháp xửlý sốliệu . 46
2.2.11. Đạo đức trong nghiên cứu . 46
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN . 44
3.1. Phân lập và nuôi cấy tăng sinh tếbào gốc trung mô từmàng dây rốn người 47
3.1.1. Thu thập mẫu dây rốn 47
3.1.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy mô tách màng dây rốn và khảnăng bám dính 47
3.1.2.1. Thời gian nuôi cấy mô 47
3.1.2.2. Kết quảnuôi cấy màng dây rốn phân lập tếbào . 49
3.1.3. Khảo sát môi trường cơbản phân lập và nuôi cấy tếbào gốc . 52
3.1.4. Thời gian nuôi cấy mô phân lập tếbào gốc trung mô . 54
3.1.5. Khảo sát sốlần cấy chuyển mô . 60
3.1.6. Khảo sát thời gian cấy chuyển, nuôi cấy tăng sinh tếbào . 62
3.2. Kiểm định sản phẩm tếbào gốc 64
3.2.1. Định danh tếbào bằng dấu ấn bềmặt 64
3.2.2. Kiểm tra tính gốc của tếbào gốc trung mô màng dây rốn . 67
3.3. Biệt hóa tếbào gốc trung mô màng dây rốn thành tếbào dạng tạo xương 69
3.3.1. Khảo sát môi trường cơbản đểbiệt hóa tếbào gốc trung mô màng dây rốn thành tế
bào dạng tạo xương . 69
3.3.2. Khảo sát nồng độchất cảm ứng biệt hóa TBG trung mô màng dây rốn thành tếbào
dạng tạo xương 71
3.3.3. Thời gian biệt hóa tếbào gốc trung mô màng dây rốn thành tếbào dạng tạo xương . 75
3.3.4. Xác định hoạt tính Alkaline phosphatase (ALP) . 78
3.3.4. Biệt hóa tếbào . 80
3.4. Một sốbiến đổi phân tửcủa tếbào gốc trung mô màng dây rốn trong quá trình
biệt hóa thành tếbào dạng tạo xương 84
3.5. Kết quảbước đầu thửnghiệm cấy ghép tếbào tạo xương biệt hóa từtếbào gốc trung mô
trên động vật .89
KẾT LUẬN 93
KIẾN NGHỊ . 94




ĐẶT VẤN ĐỀ
Tếbào gốc (TBG) là các tếbào chưa có chức năng chuyên biệt, có khảnăng biệt
hoá thành nhiều loại tếbào khác nhau. Vì vậy, có thểsửdụng TBG đểtạo ra tếbào mới
thay thếcho các tếbào bịtổn thương hoặc mất chức năng, đem lại triển vọng trong điều trị
một sốbệnh nan y có liên quan đến thoái hóa hoặc thiếu hụt tếbào [8,11,14,15,19,
40,77,99].
Các bệnh vềxương khớp là một nhóm bệnh thường gặp và có xu hướng ngày càng
tăng, gây thiệt hại lớn vềkinh tếdo chi phí điều trịcũng nhưthiệt hại do giảm sức lao động
và nghỉviệc. Chỉriêng tại Mỹ, thống kê năm 1999 cho thấy chi phí cho nhóm bệnh này
chiếm tới 2,5% GDP (khoảng 225 tỷUSD) nhưng năm 2004 đã lên tới 849 tỷUSD
chiếm tới 7,7% GDP. ỞViệt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu vềdịch tễcác bệnh
xương khớp đã được tiến hành: tỷlệloãng xương ởphụnữtrên 50 tuổi tại Hà nội là 23%
và tại thành phốHồChí Minh là 17%. Cùng với sựgia tăng vềtuổi thọ, ngoài các bệnh
loãng xương và một sốbệnh khác liên quan đến bệnh xương khớp, tổn thương sụn, thoái
hóa khớp và cột sống đang trởthành vấn đềquan trọng. Cùng với sựphát triển không
ngừng của khoa học kỹthuật, công nghệtếbào gốc đã mởra một hướng mới trong điều trị
các bệnh vềxương khớp và đã được ứng dụng ởnhiều quốc gia trên thếgiới và một số
bệnh viện trong nước. Các kết quả điều trịcho thấy việc điều trịbằng tếbào gốc nói chung
và các tếbào gốc trung mô nói riêng có kết quảtốt trong tái tạo xương, sụn [30, 124, 138].
Ghép TBG từtuỷxương tựthân đã được dùng trên lâm sàng để điều trịthành công
các trường hợp gãy xương lâu liền và khớp giả[5,6,7,9,10,16]. Phương pháp điều trị
thường là tiêm trực tiếp các tếbào gốc từtuỷxương vào ổgãy xương. Khi được tiêm vào ổ
gãy xương, các TBG trung mô của tủy xương biệt hoá in vivothành các tếbào tạo xương
(TBTX) và tái tạo lại ổgãy xương. Ngoài ra các TBG trung mô từtuỷxương có thể được
phân lập và biệt hoá ex vivothành các tếbào tạo xương trước khi được ghép trởlại ổ
khuyết xương của bệnh nhân [11,13,14,16]. Tuy nhiên, qui trình thu thập TBG từtủy
xương tương đối phức tạp và sốlượng TBG thu được không nhiều, nhất là ởbệnh nhân
gãy xương lâu liền do nguyên nhân bệnh lý của xương và tủy xương.
Dây rốn trẻsơsinh là nguồn cung cấp TBG có nhiều ưu điểm cảvềphương diện kỹ
thuật cũng như đạo đức. Dây rốn có nhiều loại TBG bao gồm TBG tạo máu, TBG biểu mô,
TBG trung mô, TBG nội mô chứa trong máu dây rốn, trong lớp gel Wharton hay trong lớp
màng bao dây rốn. TBG dây rốn được thu thập ngay khi sinh và có thểbảo quản đông lạnh
hay lưu giữtrong ngân hàng nhưmột nguồn TBG dựtrữ đểsửdụng bất kỳkhi nào cho chủ
nhân sinh học của mẫu tếbào. TBG trung mô từdây rốn tương tựnhưcác TBG trung mô ở
tủy xương, do đó có thểsửdụng chúng nhưmột nguồn TBG thay thếcho TBG ởtủy
xương [49,50,64].
Để ứng dụng điều trịvết thương xương sớm có kết quả, các TBG cần được biệt hóa
thành tếbào tạo xương trước khi được cấy ghép vào ổgãy xương. Theo cách này, các TBG
trung mô được phân lập, sau đó được tăng sinh và biệt hóa in vitrothành các tếbào khi
quan sát dưới kính hiển vi có hình dạng giống tếbào tạo xương (gọi tắt là tếbào dạng tếbào tạo
xương hay tếbào dạng tạo xương) bằng cách bổsung các yếu tốkích thích biệt hóa và tạo
xương vào môi trường nuôi cấy, bao gồm các cytokine, các vitamin và canxi. Đặc biệt, để
điều trịcác khuyết hổng xương lớn nhưmất đoạn xương, các tếbào tạo xương còn được
nuôi trong các giá đỡgiá đỡtếbào, tạo thành vật liệu thay thếxương (hay xương nhân
tạo). Từ đây, khi cấy ghép, các tếbào tạo xương trong đoạn xương nhân tạo sẽkết hợp với
các tếbào khác từtổchức xương lân cận hình thành cấu trúc xương mới hàn gắn khuyết
hổng xương [12,13,14].
Xuất phát từnhững cơsởlý luận và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên
cứu đềtài: “Nghiên cứu biệt hóa tếbào gốc trung mô màng dây rốn người thành tếbào
dạng tạo xương” với các mục tiêu sau:
1. Thu nhận và nuôi cấy tăng sinh tếbào gốc trung mô từmàng bao dây rốn người
làm vật liệu đểbiệt hóa tếbào.
2. Biệt hoá in vitro tếbào gốc trung mô màng dây rốn người theo hướng thành tế
bào dạng tạo xương nhằm ứng dụng điều trịtổn thương xương.