Thạc Sĩ Nghiên cứu bệnh virus khảm lùn ngô (Sugarcane mosaic virus - SCMV), tại vùng Chương Mỹ, Đan Phượng (

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT
NĂM - 2012
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU . 1
1. Tính cấp thiết của đề tài 1
2. Mục đích và yêu cầu . 2
2.1. Mục đích . 2
2.2. Yêu cầu . 2
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2
3.1. Ý nghĩa khoa học . 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn . 3
4. Những đóng góp mới của đề tài 3
5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu . 3
5.1. Đối tượng nghiên cứu 3
5.2. Phạm vi nghiên cứu . 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
1.1. Cơ sở khoa học của đề tài 4
1.2. Những nghiên cứu ngoài nước . 4
1.2.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới . 4
1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh virus hại ngô trên thế giới 5
1.2.3. Giới thiệu chung về chi Potyvirus 25
1.2.4. Phương pháp chẩn đoán virus bằng ELISA 27
1.2.5. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) . 31
1.2.6. Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction) . 32
1.2.7. Phương pháp hiển vi điện tử . 32
1.3. Những nghiên cứu trong nước . 32
1.3.1. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam 32
1.3.2. Những nghiên cứu về bệnh virus hại ngô ở Việt Nam 35
1.3.3. Phân loại SCMV ở Việt Nam . 38
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 39
2.1. Vật liệu nghiên cứu . 39
2.1.1. Mẫu giống ngô, cây thí nghiệm và côn trùng môi giới . 39
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hoá chất nghiên cứu . 40
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu . 41
2.2.1. Thời gian 41
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu 41
2.3. Nội dung nghiên cứu . 41
2.4. Phương pháp nghiên cứu . 41
2.4.1. Phương pháp xác định virus bằng huyết thanh . 41
2.4.2. Phương pháp xác định virus bằng RT-PCR 43
2.4.3. Xác định virus bằng phương pháp hiển vi điện tử 47
2.4.4. Phương pháp điều tra ngoài đồng . 47
2.4.5. Phương pháp xác định sự lan truyền của virus khảm lùn ngô (SCMV) bằng tiếp xúc cơ học 48
20.4.6. Phương pháp xác định sự lan truyền của virus khảm lá ngô (SCMV) bằng côn trùng môi giới . 50
2.4.7. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của virus khảm lùn cây ngô(SCMV) đến một số chỉ tiêu sinh trưởng phát triển của ngô . 51
2.4.8. Phương pháp sản xuất và thử nghiệm kháng huyết thanh virus SCMV 52
2.4.9. Phương pháp tính và xử lý số liệu . 54

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . 56
3.1. Xác định nguyên nhân gây bệnh khảm lùn ngô . 56
3.1.1. Mô tả triệu chứng bệnh virus khảm lùn ngô . 56
3.1.2. Kiểm tra một số loại virus gây hại ngô ngoài đồng tại các vùng khác nhau, vụ xuân 2009 - 2010 bằng phương pháp ELISA
gián tiếp . 60
3.1.3. Kiểm tra virus khảm lùn ngô (SCMV) vụ xuân 2010 - 2011 bằng phương pháp RT- PCR 61
3.1.4. Phương pháp hiển vi điện tử . 63
3.2. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm lan truyền của virus SCMV 66
3.2.1. Khả năng lan truyền của virus SCMV bằng phương pháp tiếp xúc cơ học . 66
3.2.2. Khả năng lan truyền của virus SCMV bằng côn trùng môi giới (rệp cờ ngô Rhopalosiphum maydis) 68
3.2.3. Khả năng lan truyền của virus SCMV qua tiếp xúc cơ học từ nguồn hạt cây nhiễm bệnh 69
3.3. Điều tra bệnh virus khảm lùn ngô ngoài đồngtại Đan Phượng và Chương Mỹ (Hà Nội) 74
3.3.1. Điều tra bệnh khảm lùn ngô ngoài đồng . 74
3.3.2. Ảnh hưởng của bệnh đến các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất ngô 96
3.3.3. Ảnh hưởng của bệnh virus tới hàm lượng diệp lục và thành phần hoá sinh hạt ngô 100
3.3.4. Ảnh hưởng của bệnh virus tới các yếu tố cấu thành năng suất ngô .102
3.4. Thử nghiệm tạo kháng huyết thanh đặc hiệu virus SCMV . 106
3.4.1. Giới thiệu 106
3.4.2. Tinh chiết virus .107
3.4.3. Kiểm tra sự có mặt của kháng thể SCMV trong cơ thể thỏ thí nghiệm sau các tuần tiêm 109
3.4.4. Thực hiện điều kiện phản ứng với kháng huyết thanh virus SCMV đã tạo được 112
3.4.5. Kiểm tra sự có mặt của virus SCMV gây hại trên các bộ phận cây ngô thu thập trong vụ xuân 2011 bằng phương pháp ELISA .120
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 127
4.1. Kết luận . 127
4.2. Đề nghị 128
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN . 128
TÀI LIỆU THAM KHẢO 130
PHỤ LỤC . 139


DANH MỤC CÁC BẢNG
Số TT Tên đề mục Trang
1.1. Diện tích, năng suất, sản lượng ngô trên thế giới từ năm 1961 - 2010 5
1.2. Phân loại họ Potyviridae (Berger et al. 2005) . 26
1.3. Diện tích, năng suất, sản lượng ngô Việt Nam từ năm 1961 - 2010 . 34
3.1. Kết quả kiểm tra virus SCMV gây hại trên ngô và cây ký chủ ngoài đồng, vụ xuân 2009 - 2010 bằng phương pháp ELISA
gián tiếp . 60
3.2. Kết quả kiểm tra virus khảm lùn ngô (SCMV) bằng phương pháp RT-PCR 62
3.3. Kết quả lây nhiễm virus SCMV lên cây chỉ thị, cây trồng và cỏ dại bằng phương pháp tiếp xúc cơ học 67
3.4. Kết quả xác định khả năng lan truyền của virus SCMV qua rệp cờ ngô Rhopalosiphum maydis . 69
3.5. Kết quả xác định khả năng lan truyền của virus SCMV bằng phương pháp tiếp xúc cơ học từ nguồn cây nhiễm bệnh .70
3.6. Tình hình bệnh virus SCMV hại ngô trên giống ngô LVN – 4 tại xã Thủy Xuân Tiên – Chương Mỹ - Hà Nội vụ xuân các năm
2007 đến 2010 75
3.7. Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô trên giống ngô LVN – 4 tại xã Đồng Tháp – Đan Phượng - Hà Nội vụ xuân các năm 2007 đến
2010 77
3.8. Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô trên bộ giống trung ngày (Viện nghiên cứu ngô, vụ xuân 2007) . 79
3.9. Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô trên bộ giống trung ngày (Viện nghiên cứu ngô, vụ xuân 2008) . 81
3.10. Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô trên bộ giống trung ngày (Viện nghiên cứu ngô, vụ xuân 2009) . 83
3.11. Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô trên bộ giống trung ngày (Viện nghiên cứu ngô, vụ xuân 2010) . 85
3.12. Tình hình bệnh khảm lùn ngô SCMV hại ngô trên bộ giống trung ngày (Viện nghiên cứu ngô, vụ thu 2007) 87
3.13. Tình hình bệnh khảm lùn ngô trên bộ giống trung ngày Viện nghiên cứu ngô, vụ thu 2008 89
3.14. Tình hình bệnh virus hại ngô trên bộ giống trung ngày Viện nghiên cứu ngô, vụ thu 2009 91
3.15. Tình hình bệnh khảm lùn ngô SCMV hại ngô trên bộ giống trung ngày tại Viện nghiên cứu ngô vụ thu 2010 93
3.16. Tình hình cây bị rệp và tỷ lệ bệnh virus tại Chương Mỹ và Đan Phượng (Hà Nội) vụ xuân 2008 95
3.17. Ảnh hưởng của bệnh khảm lùn ngô (SCMV) đến khả năng sinh trưởng của giống ngô LVN 10 97
3.18. Ảnh hưởng của bệnh khảm lùn ngô (SCMV) đến khả năng sinh trưởng của giống ngô LVN 14 98
3.19. Ảnh hưởng của bệnh khảm lùn ngô (SCMV) đến khả năng sinh trưởng của giống ngô LVN 99 99
3.20. Ảnh hưởng của bệnh khảm lùn ngô (SCMV) đến khả năng sinh trưởng của giống ngô KK 159 100
3.21. Ảnh hưởng của bệnh khảm lá ngô (SCMV) tới hàm lượng diệp lục lá và thành phần hoá sinh của hạt ngô LVN 10 . 101
3.22. Ảnh hưởng của bệnh khảm lùn ngô SCMV tới các chỉ tiêu cấu thành năng suất trên các giống ngô LVN 10 . 103
3.23. Ảnh hưởng của bệnh khảm lùn ngô SCMV tới các chỉ tiêu cấu thành năng suất trên các giống ngô LVN 14 . 104
3.24. Ảnh hưởng của bệnh khảm lùn ngô SCMV tới các chỉ tiêu cấu thành năng suất trên các giống ngô LVN 99 . 105
3.25. Ảnh hưởng của bệnh khảm lùn ngô SCMV tới các chỉ tiêu cấu thành năng suất trên các giống ngô KK 159 105
3.26. Kiểm tra ELISA hàm lượng virus SCMV trong các sản phẩm thu được trong quá trình tinh chiết virus . 108
3.27. Kiểm tra sự có mặt của kháng thể SCMV trong cơ thể thỏ thí nghiệm sau các tuần tiêm . 109
3.28. Kết quả xác định ngưỡng pha loãng dịch cây với kháng huyết thanh virus SCMV 112
3.29. Kết quả xác định ngưỡng pha loãng kháng huyết thanh virus SCMV . 115
3.30. Kết quả thử nghiệm dùng dịch cây khoẻ hấp phụ chéo và không dùng dịch cây khoẻ hấp phụ chéo . 116
3.31. Kết quả thử nghiệm dùng dịch cây khoẻ hấp phụ chéo có ly tâm và dùng dịch cây khoẻ hấp phụ chéo không ly tâm .
3.32. Kết quả thử nghiệm dùng mẫu tươi, mẫu khô với kháng huyết thanh virus SCMV 119
3.33. Kiểm tra nồng độ virus SCMV trên các bộ phận cây ngô non 3-4 lá . 120
3.34. Kiểm tra nồng độ virus SCMV trên các bộ phận cây ngô trỗ cờ đóng bắp . 121
3.35. Kiểm tra nồng độ virus SCMV qua các giai đoạn phát triển của cây ngô . 122
3.36. Kiểm tra nồng độ virus SCMV trên cây ký chủ phụ . 123
3.37. So sánh nồng độ virus SCMV trên các độ tuổi của rệp cờ ngô Rhopalosiphum maydis và các loại đệm chiết . 124
3.38. Kiểm tra virus SCMV trên các giống ngô tại Viện nghiên cứu ngô Đan Phượng, Hà Nội năm 2011 . 125

DANH MỤC CÁC HÌNH
Số TT Tên đề mục Trang
1.1. Phân tích phát sinh chủng loại của các chuỗi protein axit amin ở chủng SCMV 25
1.2. thái virion và thể vùi của potyvirus . 27
1.3. Các kỹ thuật ELISA khác nhau (Hull, 2002) 31
2.1. Sơ đồ tinh khiết virus Sugarcane mosaic virus - SCMV 46
3.1. Bệnh khảm lùn ngô do SCMV triệu chứng toàn cây . 58
3.2. Bệnh khảm lùn ngô do SCMV triệu chứng trên lá 58
3.3. Bệnh khảm lùn ngô do virus SCMV trên lá ngô . 59
3.4. Kết quả kiểm tra SCMV bằng phương pháp RT-PCR trên một số mẫu ngô, mía, cỏ thu thập ngoài đồng vụ xuân 2011 62
3.5. Sợi virus SCMV sau khi đã được làm tinh khiết từ mẫu thu được ở Huyện Chương Mỹ – Hà Nội . 64
3.6. Thể vùi của virus nằm trong tế bào lá ngô tại Chương Mỹ - Hà Nội 64
3.7. Thể vùi của virus nằm trong tế bào lá mía tại Đan Phượng - Hà Nội 65
3.8. Tiểu thể phytoplasma trên cây ngô nhiễm bệnh thu tại Lạng Sơn 65
3.9. Các thể virus ở cây ngô bị nhiễm bệnh lùn sọc đen thu tại Nghệ An 66
3.10. Triệu chứng nhiễm virus SCMV trên giống thuốc lá N. Tabacum cv. Xanthi-nc 71
3.11. Triệu chứng nhiễm virus SCMV trên giống thuốc lá N. tabacum cv. White Burley 71
3.12. Triệu chứng nhiễm virus SCMV trên giống thuốc lá N.tabacum cv. Samsun, . 71
3.13. Triệu chứng nhiễm virus SCMV trên giống mía đỏ 71
3.14. Triệu chứng nhiễm virus SCMV trên giống ngô KK 159 72
3.15. Triệu chứng nhiễm virus SCMV trên giống ngô LVN 14 . 72
3.16. Triệu chứng nhiễm virus SCMV trên cây Hoàng Tinh 73
3.17. Triệu chứng nhiễm virus SCMV trên cây mía 73
3.18. Lây bệnh nhân tạo bằng rệp ngô Rhopalosiphum maydis trên cây ngô 73
3.19. Lây bệnh nhân tạo bằng rệp ngô Rhopalosiphum maydis trên
cây thuốc lá N. tabacum cv. White Burley 73
3.20. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh (%) tại xã Thủy Xuân Tiên - Chương Mỹ - Hà Nội . 76
3.21. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh (%) tại xã Đồng Tháp - Đan Phượng - Hà Nội 78
3.23. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện nghiên cứu ngô, vụ xuân 2007 . 80
3.24. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện nghiên cứu ngô, vụ xuân 2008 . 82
3.25. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện nghiên cứu ngô, vụ xuân 2009 . 84
3.26. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện nghiên cứu ngô, vụ xuân 2010 . 86
3.27. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện nghiên cứu ngô, vụ thu 2007 88
3.28. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày vụ thu 2008 tại Viện nghiên cứu ngô 90
3.29. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện nghiên cứu ngô, vụ thu 2009 92
3.30. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện nghiên cứu ngô, vụ thu 2010 94
3.31. Tỷ lệ cây bị rệp và tỷ lệ bệnh virus tại Chương Mỹ và Đan Phượng (Hà Nội) vụ xuân 2008 95
3.32. Rệp cờ ngô Rhopalosiphum maydis hại ngô . 96
3.33. Sản phẩm kháng huyết thanh virus SCMC tạo được . 109
3.34. ELISA kiểm tra sự có mặt kháng thể virus SCMV trong kháng huyết thanh . 111
3.35. ELISA đánh giá độ hòa loãng của kháng huyết thanh . 111
3.36. Kiểm tra SCMV trên ngô, cao lương, cỏ voi . 126
3.37. Kết quả kiểm tra ELISA trên tập đoàn giống ngô ở Viện nghiên cứu ngô Đan Phượng, Hà Nội . 126
3.38. Kết quả kiểm tra ELISA trên rệp hại ngô ở Viện nghiên cứu ngô Đan Phượng, Hà Nội 126

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài

Ngô là một trong các cây lương thực quan trọng, góp phần nuôi sống khoảng 1/3 dân số trên thế giới. Diện tích trồng ngô trên thế giới năm 2010 đạt khoảng 159,32 triệu ha, năng suất 5,24 tấn/ha và sản lượng đạt 853,03 tấn (FAO STAS, USAD 2010) [59]. Những nước trồng ngô chính ở trên thế giới là Hoa Kỳ, Trung Quốc và Brazil. Gần đây bắp ngô bao tử được coi như một loại thực phẩm cao cấp.
Ở Việt Nam, cây ngô được trồng cách đây khoảng 300 năm (Ngô Hữu Tình và CTV, 1997) [33]. Ngô là cây lương thực thứ hai sau cây lúa, được trồng nhiều ở các tỉnh như Sơn La, Hà Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng, Hòa Bình, Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Đắc Nông, Ninh Thuận, Bình Thuận, Đồng Nai, An Giang, Đồng Tháp. Diện tích trồng ngô ở Việt Nam ngày càng tăng. Năm 1990 diện tích đạt 432.000 ha, sản lượng 671 tấn/ha và năng suất đạt 1,55 tấn/ha. Năm 2010 diện tích 1.126.900 ha, sản lượng 4,600,000 tấn/ha và năng suất đạt 4,09 tấn/ha. (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2011) [4].
Tuy vậy, sản lượng ngô trong nước vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu hàng năm nước ta còn phải nhập khẩu ngô (trị giá trên 500 triệu USD) để sản xuất thức ăn gia súc. Cây ngô ngày càng có vai trò quan trọng ở nước ta.
Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa trong năm có mùa đông lạnh ở phía Bắc. Đây là điều kiện để bệnh virus hại ngô ở Việt Nam phát triển phong phú về số lượng và chủng loại. Bệnh virus ngô đã gây ra những thiệt hại và là mối đe dọa cho nghề trồng ngô trong một tương lai không xa. Bệnh virus gây thoái hóa dẫn đến tàn lụi cây ngô có thể hủy diệt những diện tích nhỏ trong sản xuất. Bệnh làm giảm năng suất và phẩm chất ngô hạt.
Bệnh khảm lùn ngô do virus Sugarcane mosaic virus - SCMV gây là bệnh virus phổ biến nhất trên ngô và mía ở Việt Nam. Cây ngô bị bệnh có triệu chứng khảm rất dễ nhận biết. Toàn cây được biến dạng, lùn thấp, cây có thể ra bắp hoặc không ra bắp nhưng nếu có bắp thì bắp teo lép, nhỏ, ngắn ảnh hưởng rất lớn đến năng suất và sản lượng ngô. Xuất phát từ tình hình trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bệnh virus khảm lùn ngô (Sugarcane mosaic virus - SCMV), tại vùng Chương Mỹ, Đan Phượng (Hà Nội) và sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán bệnh”.
2. Mục đích và yêu cầu
2.1. Mục đích
Xác định nguyên nhân gây bệnh, mức độ phổ biến bệnh và sản xuất
kháng huyết thanh chẩn đoán nhanh bệnh hại.
2.2. Yêu cầu
- Xác định virus gây bệnh khảm lùn ngô.
- Nghiên cứu khả năng lan truyền của virus gây bệnh.
- Xác định triệu chứng bệnh trên ngô và điều tra mức độ phổ biến của virus gây bệnh trên đồng ruộng.
- Sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán bệnh hại.