Thạc Sĩ Nghiên cứu bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus) ở miền Bắc Việt Nam

Luận văn thạc sĩ năm 2011
Đề tài: Nghiên cứu bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus) ở miền Bắc Việt Nam

MỤC LỤC
Lời cam ñoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục chữ viết tắt vi
Danh mục bảng biểu vii
Danh mục hình viii
1 ðẶT VẤN ðỀ i
1.1 Tính cấp thiết của nghiên cứu 1
1.2 Mục ñích – yêu cầu 3
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1 Bệnh vàng lụi trên thế giới và Việt Nam 4
2.2 Triệu chứng gây hại 6
2.3 Phân loại, hình thái và ñặc ñiểm bộ gen virus RYSV 7
2.4 Lan truyền của RYSV 10
2.5 Phương pháp chẩn ñoán virus bằng ELISA 11
2.5.1 Nguyên lý của phương pháp huyết thanh học và ứng dụng 11
2.5.2 Chế tạo kháng huyết thanh ña dòngñối với virus thực vật 12
2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến nồng ñộ kháng thể 12
2.5.4 Các kỹ thuật ELISA 13
2.6 Chẩn ñoán virus RYSV bằng ELISA 14
3 ðỊA ðIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
3.1 Nội dung nghiên cứu 15
3.2 ðịa ñiểm nghiên cứu chính 15
3.3 Vật liệu liệu nghiên cứu chính 15
3.3.1 Vật liệu thu thập mẫu cây và rầy 15
3.3.2 Vật liệu thử nghiệm tạo kháng huyết thanh và chẩn ñoán ELISA 15
3.3.3 Hóa chất, dung dịch ñệm, môi trường 15
3.3.5 Các enzyme và kit thương mại 16
3.3.6 Các thiết bị chủ yếu 17
3.4 Phương pháp nghiên cứu 17
3.4.1.Phương pháp ñiều tra bệnh ñồng ruộng 17
3.4.2 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu 17
3.4.3 Phương pháp bảo quản mẫu 18
3.4.4 Phương pháp chiết RNA tổng số từ mô lá 18
3.4.5 Phản ứng RT – PCR 19
3.4.6 ðiện di agarose 21
3.4.7 Dòng hóa và giải trình tự 21
3.4.8 Phân tích trình tự 22
3.4.9 Tinh chiết phân tử virus RYSV 22
3.4.10 Tạo kháng huyết thanh virus trên thỏ 23
3.4.11 Phương pháp ELISA 23
4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25
4.1 ðiều tra bệnh vàng lụi năm 2011 25
4.1.1 Triệu chứng bệnh vàng lụi tại các ñiểm ñiều tra 25
4.1.2 ðiều tra tình hình bệnh vụ xuân năm 2011 27
4.1.3 ðiều tra bệnh vụ mùa 2011 29
4.1.4 Phát hiện virus RYSV bằng RT-PCR trên các mẫuthu thập ngoài
ñồng ruộng vụ xuân 2011 30
4.2 Thử nghiệm tạo kháng huyết thanh ñặc hiệu virusRYSV 33
4.2.1 Giới thiệu 33
4.2.2 Chuẩn bị nguồn vật liệu 33
4.2.3 Tinh chiết phân tử virus 34
4.2.4 Gây miễn dịch trên thỏ 35
4.2.5 Kiểm tra sự có mặt của kháng thể virus 35
4.2.6 ðánh giá chất lượng của 2 nguồn kháng huyết thanh (huyết tương và
dịch trên tủa sau ly tâm máu ñông). 37
4.2.7 Kiểm tra nồng ñộ virus trong quá trình tinh chiết 40
4.2.8 ðánh giá ñộ hòa loãng của kháng huyết thanh 42
4.2.9 ðánh giá ñộ hòa loãng của mẫu cây bệnh 43
4.2.10 Kiểm tra nồng ñộ virus ở mẫu lá vàng và lá xanh trên cùng một cây bệnh. 44
4.2.11 ðánh giá về mẫu khô, mẫu tươi và mẫu nghiền,mẫu không nghiền 46
4.2.12 Kiểm tra nồng ñộ virus ở các bộ phận khác nhau của cây bệnh 47
4.2.13 Kiểm tra virus trong mẫu rầy xanh ñuôi ñen và một số loại cỏ tại Bắc
Giang năm 2011 49
4.2.14.Ứng dụng ELISA kiểm tra virus RYYSV thu tại ở Hà Nội, Bắc Giang
năm 2011 51
4.3 Xác ñịnh virus RYSV bằng giải trình tự 52
4.3.1 Nhân gen virus bằng RT-PCR 53
4.3.2 Dòng hóa sản phẩm RT-PCR 54
4.3.3 Kết quả giải trình tự 57
4.3.4 Kết quả tìm kiếm chuỗi tương ñồng trên ngân hàng gien 58
5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 60
5.1 Kết luận 60
5.2 ðề nghị 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

1. ðẶT VẤN ðỀ
1.1 Tính cấp thiết của nghiên cứu
Lúa (Oryza sativaL.) là cây lương thực quan trọng nhất ở các nước Châu Á nói
chung và Việt Nam nói riêng. Khoảng 92% lúa gạo ñược sản xuất từ Châu Á. Việt
Nam, trong nhưng năm gần ñây là một trong các quốc gia xuất khẩu gạo hàng ñầu của
thế giới. Hiên nay, Việt Nam chỉ ñứng sau Thái Lan về xuất khẩu gạo, với lượng xuất
khẩu khoảng 5 triệu tấn, chiếm 1/5 tổng lượng gạo xuất khẩu trên thế giới.
Sản xuất lúa hiện ñang phải ñương ñầu với nhiều nguy cơ, ñặc biệt là sự tấn
công của dịch hại, trong ñó có bệnh virus. Cho tới nay có hơn 15 virus gây bệnh cho
lúa ñã ñược xác ñịnh, trong ñó có 12 virus ở Châu Á, 2 virus ở Châu phi, 1 virus ở
Châu Âu và 1 virus ở Châu Mỹ (Hibino, 1996). Tại các nước Châu Á, bệnh virus
hại lúa xảy ra ở nhiều vùng, từ năm này qua năm khác và gây thiệt hại hàng nghìn
ha luá (Bos, 1992)
Tại Việt Nam, bệnh vàng lùn do Rice grassy stunt virus (RGSV) và lùn xoắn lá
do Rice ragged stunt virus (RRSV) ñã gây ra nhiều vụ dịch nghiêm trọng trên lúa tại
miền Nam từ năm 2006. Gần ñây hơn, bệnh lùn sọc ñenso Southern rice black
streaked dwarf virus (SRBSDV) ñã và ñang gây bệnh nghiêm trọng, ñặc biệt trên
lúa mùa ở miền Bắc và miền Trung từ năm 2009 (Hà Viết Cường et al., 2009, Ngô
Vĩnh Viễn et al., 2009).
Tại Việt Nam, bệnh vàng lụi (còn gọi là bệnh vàng lá) xuất hiện ở Việt Nam từ
những năm 60 của thế kỷ trước và ñược coi là dịch hại nguy hiểm nhất, ñược xác
ñịnh do rầy xanh ñuôi ñen truyền, gây hại thành dịch tại nhiều tỉnh phía Bắc, ñặc
biệt là các tỉnh miền núi (Ngô Vĩnh Viễn và Hà MinhTrung, 2006). ðến năm 1980-1981 bệnh xuất hiện trở lại và gây hại cục bộ trên các cánh ñồng Mường Thanh
(ðiện Biên) và Phù Yên (Sơn La). Mặc dù vector truyền bệnh ñược biết là do rầy
xanh ñuôi ñen nhưng virus gây bệnh vẫn chưa ñược nghiên cứu.
Trong năm 2010, tại Bắc Giang, một bệnh trên lúa với triệu chứng vàng lá ñã
xuất hiện và gây hại trên diện rộng. Các cây lúa bịbệnh sinh trưởng phát triển kém,
lùn lụi. Theo thông báo của Chi cục BVTV Bắc Giang,bệnh ñã xuất hiện từ năm
2004 và diện tích nhiễm bệnh tới ~ 1000 ha năm 2009. Vụ mùa 2010 ở Bắc Giang,
bệnh ñã xuất hiện ở 24/26 xã của huyện, trong ñó hai xã bị nặng nhất là Hòa Sơn và
Thanh Sơn. Tới ngày 6/8/2010, tổng diện tích bị bệnh của huyện là 108 ha, nhiều
ruộng có tỷ lệ bệnh tới ~ 90 %. Ngoài ra, triệu chứng bệnh tương tự còn thấy xuất
hiện ở một số tỉnh như Hà Nam, Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An
Lúc ñầu bệnh ñã ñược cho là do các nguyên nhân sinhlý như ñất ñai, phân bón
hoặc ngẹt rễ gây ra. Tuy nhiên, dựa vào ñánh giá triệu chứng, phân tích phân tử
(PCR và giải trình tự), hiển vi ñiện tử, nguyên nhân gây bệnh vàng lá tại Bắc Giang
ñã ñược xác ñịnh chính xác là do virus Rice yellow stunt virus (RYSV) (Hà Viết
Cường et al., 2010). Virus gây bệnh còn ñược biết với tên gọi là Rice yellow
transitory virus (RYTV) ñã từng gây thành dịch nghiêm trọng tại tại nhiều tỉnh phía
nam Nam Trung Quốc kể cả ðài Loan trong những năm 60 và 70 (Ou, 1985;
Hibino, 1996).
Do ñặc ñiểm giống nhau về triệu chứng, vector truyền bệnh nên tên bệnh vàng
lá Bắc Giang ñược ñề xuất là bệnh vàng lụi (Hà ViếtCường et al., 2010).
Mặc dù tác nhân gây bệnh vàng lụi lúa tại Việt Nam ñã ñược xác ñịnh là do
RYSV nhưng nhiều vấn ñề liên quan ñến virus ñều phải ñược nghiên cứu bao gồm:
(i) bản thân virus (ñặc ñiểm hình thái, phân tử/di truyền, phân loại, chẩn ñoán ),
(ii) các ñặc trưng sinh học (phạm vi ký chủ, quan hệ vector, tính chất gây bệnh, tính
hướng mô, chức năng gen ), (iii) dịch tễ bệnh (ảnh hưởng tương tác của 3 yếu tố
bệnh học là ký chủ - ñiều kiện ngoại cảnh - virus ñến sự phát triển bệnh trên qui mô
quần thể) và (iv) phòng chống (các chiến lược và chiến thuật phòng trừ bệnh).
Trong các nội dung nghiên cứu trên thì nghiên cứu chẩn ñoán chính xác bệnh
là yêu cầu bức thiết vì triệu chứng ñiển hình của bệnh là bộ lá bị biến vàng, cây lùn
nhưng lại có khả năng mất triệu chứng trong một số trường hợp dẫn tới bệnh rất dễ
bị nhầm do các nguyên nhân khác.
Xuất phát từ thực tế trên, dưới sự hướng dẫn của TS. Hà Viết Cường, chúng
tôi tiến hành ñề tài: “Nghiên cứu bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus) ở
miền Bắc Việt Nam”
1.2. Mục ñích – yêu cầu
Mục ñích
ðánh giá tình hình bệnh vàng lụi trên lúa năm 2011 tại một số ñịa ñiểm miền
Bắc và phát triển kỹ thuật chẩn ñoán virus vàng lụi(RYSV)
Yêu cầu
ãðiều tra bệnh vàng lụi, kiểm tra virus bằng RT- PCR và ELISA.
ãThử nghiệm tạo kháng huyết thanh ñặc hiệu phân tử virus RYSV và ñánh
giá các ñiều kiện ñể tối ưu hóa phản ứng ELISA.
ãDòng hóa và giải trình tự một phần gen virus RYSV.

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Bệnh vàng lụi trên thế giới và Việt Nam
Bệnh vàng lùnlúa (rice yellow stunt disease) ñược phát hiện ñầutiên ở tỉnh
Quảng Tây (Trung Quốc) năm 1957 và ñược công bố chính thức năm 1965 (Fang et
al. 1994). Cũng trong năm này, một bệnh trên lúa gọi là bệnh vàng tạm thời(rice
transitory yellowing disease) ñã gây thành dịch ở ðài Loan (Chiu et al., 1965) và
virus gây bệnh ñược gọi là RTSV (Rice transitory yellowing virus). Tại Việt Nam,
bệnh “vàng tạm thời” tại ðài Loan ñã ñược dịch là bệnh “vàng lá di ñộng”.
Tên bệnh “vàng tạm thời” và tên virus RTSV ñã xuất hiện trên nhiều tài liệu,
chủ yếu do các tác giả Nhật Bản và ðài Loan, thậm chí ñể chỉ cả bệnh “vàng lùn” ở
lục ñịa Trung Quốc (Shikita, 1972; Ou, 1985). Triệu chứng bệnh của 2 loại bệnh
này trên cây lúa ñược mô tả giống nhau: lá lúa bị vàng, nhiều nhất là lá phía dưới,
cây lúa còi cọc và giảm số nhánh ở các cây bị bệnh và làm giảm năng suất lúa.
Bệnh “vàng lùn” hay bệnh “vàng tạm thời” ñã từng gây thành dịch tại nhiều
tỉnh phía nam trong những năm 60 và 70 như ðài Loan(1960 – 1962, 1973 – 1980),
các tỉnh phía nam sông Dương Tử như Quảng ðông (1964-1966, 1979), Phúc Kiến
(1966, 1969, 1973), Chiết Giang (1970 – 1973) (Ou, 1985; Hibino, 1996). Tại Việt
Nam, trong cùng thời gian, một bệnh biến vàng trên lúa gọi là bệnh “vàng lụi” do
rầy xanh ñuôi ñen truyền ñã gây thành dịch ở miền Bắc, ñặc biệt tại các tỉnh miền
núi (Ngô Vĩnh Viễn và Hà Minh Trung, 2006). Mặc dù mẫu bệnh vàng lụi của Việt
Nam không ñược lưu giữ nhưng ñối chiếu bệnh “vàng lùn” hay “vàng tạm thời” của
Trung Quốc và bệnh “vàng lụi” của Việt Nam thấy có nhiểu ñiểm giống nhau về (i)
triệu chứng, (ii) vector và (iii) ñặc biệt là sự xuất hiện các vụ dịch trong cùng thời
gian, tại các khu vực gần gũi về mặt ñịa lý. Rất cóthể, bệnh “vàng lụi” tại Việt Nam
chính là bệnh “vàng lùn” hay “vàng tạm thời” tại Trung Quốc (Hà Viết Cường et
al., 2010) (Hình 2.1).
Hình 2.1. Phân bố dịch bệnh “vàng lụi” tại Việt Nam, bệnh “vàng lùn” tại phía
Nam Trung Quốc và “vàng tạm thời” tại ðài Loan (cáchình tam giác ñỏ)
trong những năm 60, 70 (Hà Viết Cường, Báo cáo hội thảo quốc gia Bệnh cây
năm 2011 tổ chức tại ðH Nông nghiệp Hà Nội)
Tại Việt Nam, Viện Bảo vệ thực vật ñã có nhiều nghiên cứu về bệnh vàng lụi
trong những năm 1980-1981, mẫu bệnh ñược chụp trên kính hiển vi ñiện tử tại Viện
vệ sinh dịch tễ Hà Nội và ñã kết luận bệnh vàng lụixuất hiện ở các tỉnh miền núi
phía Bắc giống như bệnh vàng lá di ñộng gây hại ở ðài Loan (Ngô Vĩnh Viễn và Hà
Minh Trung, 2006).
Gần ñây, tại Bắc Giang, một bệnh với triệu chứng vàng lá ñã xuất hiện
và gây hại trên diện rộng. Các cây lúa bị bệnh sinhtrưởng phát triển kém, lùn
lụi. Theo thông báo của Chi cục BVTV Bắc Giang, bệnh ñã xuất hiện từ năm
2004 nhưng vì là bệnh mới, không xác ñịnh ñược nguyên nhân gây bệnh nên
không thống kê diện tích nhiễm. Các năm tiếp theo, Chi cục ñã thống kê mức
ñộ gây hại của bệnh như sau:
ã Năm 2005:diện tích nhiễm (DTN) 60 ha ở Hiệp Hòa.
ã Năm 2006: Bệnh phát sinh rộng, chủ yếu ở Hiệp Hòa, DTN 200 ha với tỷ lệ
bệnh trung bình 10-20%, diện tích nhiễm nặng 30 ha với tỷ lệ bênh 50-60%.
Huyện tổ chức phòng trừ trên diện tích 100 ha, áp dụng các biện pháp như
ñối với bệnh sinh lý nhưng không có kết quả.
ã Năm 2007: DTN 13 ha ở Hiệp Hòa, Lạng Giang.
ã Năm 2008: DTN > 1 ha ở Hiệp Hòa.
ã Năm 2009: DTN lên tới 914,5 ha, mất trắng > 4,5 ha,xuất hiện ở hầu hết các
huyện, riêng Hiệp Hòa 600 ha. Các biện pháp phòng chống bệnh như ñối với
bệnh sinh lý ñã ñược áp dụng trên diện tích 605 ha nhưng không có kết quả.
ã Vù mùa 2010, bệnh cũng xuất hiện trên diện rộng, ñặc biệt tại huyện Hiệp
Hòa. Tại Hiệp Hòa, bệnh ñã xuất hiện ở 24/26 xã củahuyện, trong ñó hai xã
bị nặng nhất là Hòa Sơn và Thanh Sơn. Tới ngày 6/8/2010, tổng diện tích bị
bệnh của huyện là 108 ha, nhiều ruộng có tỷ lệ bệnhtới ~ 90 %.
Ngoài ra, triệu chứng bệnh tương tự còn thấy xuất hiện ở một số tỉnh như Hà
Nam, Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An.
Lúc ñầu bệnh ñã ñược cho là do các nguyên nhân sinhlý như ñất ñai, phân
bón hoặc ngẹt rễ gây ra. Tuy nhiên, dựa vào ñánh giá triệu chứng, phân tích phân tử
(PCR và giải trình tự), hiển vi ñiện tử, nguyên nhân gây bệnh vàng lá tại Bắc Giang
ñã ñược xác ñịnh chính xác là do virus RYSV (Rice yellow stunt virus). Do ñặc
ñiểm giống nhau về triệu chứng và vector truyền bệnh nên tên bệnh vàng lá Bắc
Giang ñược ñề xuất là bệnh vàng lụi (Hà Viết Cường et al., 2010).
2.2. Triệu chứng gây hại
Về triệu chứng, bệnh biến vàng tạm thời ở luá ñã ñược Ou (1985) mô tả như sau:
(i)Triệu chứng ñiển hình là bộ lá biến vàng, cây lùn,ñẻ nhánh giảm. Hai ñến ba
tuần sau cấy, một cây bệnh ñiển hình có 1-2 lá phíadưới bị biến vàng, sau chuyển
thành vàng sáng hoặc vàng cam tối, cuối cùng các lávàng này trở nên nhăn héo. Lá
biến vàng thường bắt ñầu từ ñỉnh lá và trên cây thìcác lá phía dưới biến vàng trước
sau ñó mới lan lên các lá phía trên. Trên các lá biến vàng, có thể xuất hiện các chấm
nhỏ màu nâu ñỏ (màu gỉ sắt). (ii)Trên giống mẫn cảm, cây bị lùn, giảm mạnh khả
năng ñẻ nhánh, trỗ kém hoặc không trỗ. Cây nhiễm sớm có thể biểu hiện triệu
chứng rõ rệt nhưng cây nhiễm muộn có thể không biểuhiện triệu chứng. Trường
hợp nặng, cây có thể chết trước khi trỗ. (iii)Bệnh ñược gọi là “vàng tạm thời” vì
cây bệnh, ñặc biệt trong ñiều kiện nhà kính, sau khi biểu hiện triệu chứng vàng lá
ñiển hình, có thể phục hồi, thậm chí không biểu hiện triệu chứng. Nhiều khi, các
dảnh trông bình thường hình thành từ một cây bệnh.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt.
1. Báo NNVN (2010). Bệnh lạ tấn công lúa mùa sớm ở Bắc Giang
2. Báo Bắc Giang (2011). Tập trung chăm sóc vụ mùa
3.Báo KTNT (15/9/2010). Miền Bắc, nguy cơ xuất hiệnbệnh vàng lụi trên lúa. Tác
giả Hữu Nguyên.
4. Chi cục Bảo vệ thực vật Bắc Giang (2010). Nguyênnhân gây bệnh vàng lá lúa và
biện pháp phòng trừ.
5. Chi cục Bảo vệ thực vật Bắc Giang (26/08/2010). Xung quanh “bệnh lạ” trên lúa
ở Hiệp Hoà, Bắc Giang: Diệt rầy ñể ngăn bệnh
6. Chi cục bảo vệ thực vật TP.HO CHI MINH (2010). Rầy xanh ñuôi ñen
7. Hà Viết Cường, Lê Văn Hải, Nguyễn Viết Hải, Vũ Triệu Mân (2010)
.Xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh vàng lùn lúa tại tỉnh Bắc Giang vụ mùa – 2010
8. Muller K.E (1992). Những thiệt hại trên ruộng lúa nhiệt ñới. Xuất bản tại IRRI.
9. Sở nông nghiệp và phát triển nông thôn Vĩnh Phúc(12/2010). Sinh vật gây hại
trên lúa
10. Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (1998). Giáo trình bệnh cây nông nghiệp, Hà Nội.
11. Vũ Triệu Mân (2004). Phương pháp chẩn ñoán nhanh bệnh virus hại cây trồng.
NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
Tài liệu nước ngoài
12.Chang, S., Puryear, J. & Cairney, J. (1993). A Simple and Efficient Method for
Isolating RNA from Pine Trees. Plant Molecular Biology Reporter11: 113-116
13. Chen,1983, Plant prot, Bull, pp 25-254.
14. Chiu RJ, Lo TC, Pi CT, Chen MH (1965). Transitory yellowing of rice and its
transmission by the leafhoppers Nephotettix apicalis (Motsch.). Bot Bull Acad Sin
15.EISHIRO SHIKATA AND MOH-JIH CHEN (1969). Electron Microscopy of
Rice Transitory Yellowing Virus. JOURNAL OF VIROLOGY, Feb. 1969, Vol. 3,
No. 2, p. 261-264
16.Fang, R. X., Wang, Q., Xu, B. Y., Pang, Z., Zhu,H. T., Mang, K. Q.,Gao, D. M.,
Qin, W. S. & Chua, N. H. (1994). Structure of the nucleocapsid protein gene of
rice yellow stunt rhabdovirus. Virology. 204, 367–375.
17.Hibino, H. (1996). Biology and epidemiology of rice viruses. Annual Review of
Phytopathology34, 249-274.
18.Hiraguri, A., Hibino, H., Hayashi, Shimizu, T.T., Uehara-Ichiki, T., Omura, T. &
Sasaya, T. (2009). Complete sequence analysis of rice transitory yellowing virus
and its comparison to rice yellow stunt virus. Archives of Virology. 155:243–245
19.Inoue, H. (1978). Transmission efficiency of rice transitory yellowing virus by
the green plant hoppers, Nephotettix spp. (Hemiptera: Cicadellidae). Applied
Entomology and Zoology. 14:123-126
20.Ou, S.H. (1985). Rice Diseases. Second Edition, p. 23-25 & 48-49.
Commonwealth Mycological Institute Publication. Kew, Surrey, UK.
21.Shikata, E. & Chen, M.J. (1969) Electron microscopy of rice transitory
yellowing virus. Journal of Virology. 3:261–264
22.Shikata, E. (1972). Rice transitory yellowing virus. Description of Plant Viruses.
CMI/AAB No 100.
23. Gibb, A., Harrison, B (1980), Plant virology, The principles Edword Arnold
press. England, pp. 153-156; 159-167; 187-191; 208-210