Tài liệu nghiên cứu bệnh học thực vật

ĐỀ TÀI: nghiên cứu bệnh học thực vật

LỜI CẢM ƠN

Trước hết em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Phòng bệnh học phân tử - Viện di truyền nông nghiệp cùng các cán bộ công nhân viên trong phòng đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập vừa qua.
Em còng xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm - Đại học Bách Khoa Hà Nội và cô Nguyễn Xuân Sâm tạo điều kiện cho em hoàn thành đợt thực tập kỹ thuật.

LỜI MỞ ĐẦU

Viện Di truyền nông nghiệp được thành lập ngày 10/10/1989, tiền thân của Viện là Trung tâm Di truyền Nông nghiệp (thành lập năm 1984). Hiện nay, Viện nằm trên địa bàn huyện Từ Liêm, Hà Nội.
Chức năng chính của Viện là :
-Nghiên cứu, ứng dóng các phương pháp di truyền học hiện đại và công nghệ sinh học để chọn tạo các giống cây trồng có năng suất cao, phẩm chất tốt, chống chịu sâu bệnh và các điều kiện bất lợi của môt trường.
-Tạo các chủng vi sinh vật mới phục vụ bảo quản và chế biến lương thực- thực phẩm, sản xuất các loại chế phẩm sinh học phục vụ nền nông nghiệp bền vững và bảo vệ môi trường.
-Tăng cường hợp tác quốc tế và tham gia đào tạo cán bộ về lĩnh vự Di truyền và Công nghệ sinh học.
Để thực hiện được các chức năng trên, Viện đã tổ chức thành 10 đơn vị nghiên cứu và chuyển giao công nghệ với tổng số cán bộ là 116 người trong đó có 3 tiến sĩ , 6 phó giáo sư, 16 phó tiến sĩ và 8 thạc sĩ. §Ó thùc hiÖn ®­îc c¸c chøc n¨ng trªn, ViÖn ®· tæ chøc thµnh 10 ®¬n vÞ nghiªn cøu vµ chuyÓn giao c«ng nghÖ víi tæng sè c¸n bé lµ 116 ng­êi trong ®ã cã 3 tiÕn sÜ , 6 phã gi¸o s­, 16 phã tiÕn sÜ vµ 8 th¹c sÜ.
Trong những năm qua, Viện đã đạt được rất nhiều thành tựu, đã thực hiện và chủ trì 18 đề tài nhà nước, 42 đề tài cấp ngành, 8 dự án sản xuất thử, tạo được nhiều giống lúa mới và các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, tạo ra các quy trình tiến bộ kỹ thuật được công nhận. Ngoài ra, Viện còn thực hiện các dự án hợp tác quốc tế với các tổ chức UNDP, FAO . Nhờ các thành tự trên mà Viện đã nhận được nhiều giải thưởng có giá trị cả trong và ngoài nước: Giải thưởng quốc tế về đóng góp phát triển nông nghiêph Châu Trong nhưng n¨m qua, ViÖn ®· ®¹t ®­îc rÊt nhiÒu thµnh tùu, ®· thùc hiÖn vµ chñ tr× 18 ®Ò tµi nhµ n­íc, 42 ®Ò tµi cÊp ngµnh, 8 dù ¸n s¶n xuÊt thö, t¹o ®­îc nhiÒu gièng lóa míi vµ c¸c chÕ phÈm sinh häc phôc vô n«ng nghiÖp, t¹o ra c¸c quy tr×nh tiÕn bé kü thuËt ®­îc c«ng nhËn. Ngoµi ra, ViÖn cßn thùc hiÖn c¸c dù ¸n hîp t¸c quèc tÕ víi c¸c tæ chøc UNDP, FAO . Nhê c¸c thµnh tù trªn mµ ViÖn ®· nhËn ®­îc nhiÒu gi¶i th­ëng cã gi¸ trÞ c¶ trong vµ ngoµi n­íc: Gi¶i th­ëng quèc tÕ vÒ ®ãng gãp ph¸t triÓn n«ng nghiªph Ch©u Á Thái Bình Dương, huân chương lao động hạng 3 .



GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH HỌC THỰC VẬT

I. Quan niệm về bệnh hại thực vật
Việc chỉ ra được chính xác lúc nào cây bị bệnh luôn là một vấn đề khó khăn và được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Người ta cho rằng một cây được coi là khoẻ mạnh và phát triển bình thường khi nó biểu hiện các chức năng sinh lý ở mức tối đa tiềm năng di truyền của nó. Các tế bào mô phân sinh của cây khoẻ mạnh thực hiện chức năng phân chia và chuyên hoá khi cơ thể đòi hỏi là cần thiết. Các kiểu tế bào chuyên hoá khác nhau hấp thụ nước và dinh dưỡng từ đất, đưa nước và dinh dưỡng đến tất cả các bộ phận của cây, tiến hành quá trình quang tổng hợp, các quá trình chuyển hoá và trao đổi chất, hoặc lưu giữ các sản phẩm của quá trình quang tổng hợp và tạo hạt hoặc các cơ quan tái tạo khắc cho khả năng sinh tồn và phát triển. Bất cứ khi nào các tế bào của một cây hay một bộ phận nào đó của cây có khả năng thực hiện một hay nhiều chức năng đặc biệt bị can thiệp do các vi sinh vật hoặc là yếu tố môt trường bất lợi thì các hoạt động của các tế bào bị gián đoạn, bị thay đổi hay bị ức chế hoặc bị chết và cây trồng trở nên bị bệnh.
Đầu tiên bệnh mới chỉ xảy ra ở một vài tế bào và vẫn chưa biểu hiện ra nhưng chỉ trong một thời gian ngắn, bệnh lan rộng và các bộ phận cây bị bệnh bắt đầu thay đổi và biểu hiện ra ngoài các triệu chứng bệnh mà mắt thường có thể thấy được. Dùa vào những thay đổi mà cây thể hiện khi phản ứng lại sự xâm nhiễm của vi sinh vật hay ảnh hưởng của các yếu tố môi trường bất lợi mà chúng ta có thể biết được mức độ bệnh của cây. Từ đó bệnh của cây có thể được định nghĩa là : một chuỗi các phản ứng của các tế bào và các mô thực vật với các vi sinh vật gây bệnh hoặc với các yếu tố môi trường mà ta có thể nhìn thấy được hoặc không nhìn thấy được, dẫn đến những thay đổi bất lợi theo hình dạng, chức năng, hoặc tình trạng nguyên vẹn của cây trồng và có thể dẫn đến sự suy yếu hoặc có thể gây chết toàn phần hoặc từng phần của cây.
Các tác nhân gây bệnh vi sinh vật thường gây bệnh bằng cách can thiệp vào quá trình trao đổi chất của tế bào cây thông qua các enzyme, các chất độc tố, các chất điều hoà sinh trưởng và các loại chất khác mà chúng tiết ra khi tiếp xúc với cây chủ, hoặc hấp thụ dinh dưỡng của tế bào chủ phục vụ cho mục đích sử dụng của chúng. Một số sinh vật khác lại gây bệnh bằng cách sống ký sinh và phát triển, sinh sản trong hệ thống bó mạch mô gỗ hay bó mạch libe và hậu quả tất yếu là làm tắc nghẽn đường vận chuyển lên xuống của nước và của đường. Ngoài ra, các yếu tố môi trường cũng gây bệnh trên thực vật khi tác động với mức ngoài ngưỡng chống chịu của cây.
Có rất nhiều loại bệnh hại cây trồng, chúng được phân nhóm theo rất nhiều tiêu chuẩn: theo triệu chứng bệnh, theo bộ phận cây bị bệnh, theo loại cây bị bệnh . Hiện nay, phổ biến nhất là người ta phân loại bệnh cây dùa vào loại tác nhân gây bệnh. Theo tiêu chuẩn này, bệnh thực vật được chia làm 2 loại: bệnh gây ra do các yếu tố sinh học và bệnh gây ra bởi các yếu tố không sinh học. Theo tiêu chuẩn này, ta có thể chỉ ra được nguyên nhân gây bệnh, quá trình tiến triển và cách lan truyền bệnh từ đó suy ra được biện pháp phòng trừ bệnh








PHẦN I: NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

I. Khái niệm chung:

Nuôi cấy mô tế bào là một phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy những nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo và trong điều kiện vô trùng. Bao gồm:
- Nuôi cấy các cơ thể thực vật hoàn chỉnh.
- Nuôi cấy các cơ quan, bộ phận tách rời của thực vật nh­ mẩu lá, mẩu rễ, một đoạn thân, một bộ phận của hoa, quả .
- Nuôi cấy phôi non (phôi chưa phân hoá hoàn toàn), phôi trưởng thành.
- Nuôi cấy mô sẹo (callus)
- Nuôi cấy tế bào: Tế bào thực vật đơn (nuôi cấy huyền phù tế bào), tế bào trần

Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật dùa trên tính toàn năng của tế bào do Haberlandtf phát biểu (1898): Mỗi tế bào của cơ thể đa bào có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh trong điều kiện phù hợp. Cơ sở vật chất của tính toàn năng là mỗi tế bào trong cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ vật chất thông tin di truyền. Khi tạo được môi trường nuôi cấy phù hợp, sử dụng các chất điều khiển sinh trưởng thực vật, ta có thể hoạt hoá gen cần thiết để bắt một tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật phát triển được thành cây hoàn chỉnh.
Phân hoá và phản phân hoá của tế bào cũng là cơ sở lý thuyết của công nghệ này. Trong đó, sự phân hoá là việc chuyển những tế bào phôi sinh trở thành các tế bào chuyên hoá để thực hiện những chức năng khác nhau về sinh lý, sinh hoá; còn sự phản phân hoá là sự chuyển các tế bào đã chuyên hoá trở lại trạng thái phôi sinh, có khả năng phân chia để cho ra các tế bào mới.
Điều kiện để tế bào thể hiện tính toàn năng qua con đường phân hoá và phản phân hoá là môi trường nuôi cấy.

II.Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật:

Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng, nó quyết định cho sự thành công của việc nuôi cấy mô tế bào thực vật tách rời. Thành phần chính bao gồm:

1. Nguyên tố khoáng đa lượng: Là các nguyên tố như N, P, K, Mg, S, Ca .,chiếm nhiều trong môi trường nuôi cấy với hàm lượng của mỗi nguyên tố thường lớn hơn 30mg/l. Chúng là nguyên liệu để tế bào, mô thực vật xây dựng nên thành phần cấu trúc.
2. Các nguyên tố khoáng vi lượng: Là các nguyên tè nh­ Fe, Mn, Mo, B, I, Cu, Zn, Co . với hàm lượng mỗi nguyên tố nhỏ hơn 30mg/l. Chúng là thành phần của coenzim để xúc tác phản ứng hoá sinh diễn ra trong tế bào sống.
3. Nguồn cacbon: Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, các mô và tế bào chuyển sang phương thức sống dị dưỡng nên cần phải cung cấp cho chúng một nguồn cacbon hữu cơ, thường là đường mía saccaroza (trong một số trường hợp còn sử dụng glucoza, maltoza, lactoza .).
Ngoài ra, manitol, sorbitol được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền phù và tế bào trần với chức năng ổn định áp suất thẩm thấu.
4. Vitamin: Tế bào và mô thực vật trong điều kiện in vitro vẫn có khả năng tổng hợp vitamin nhưng lượng tổng hợp được không đủ nên phải bổ sung vitamin ngoại sinh vào môi trường cấy. Vitamin thường dùng là nhóm B dễ hoà tan vào trong nước như B[SUB]1[/SUB], B[SUB]2[/SUB], B[SUB]3[/SUB], B[SUB]5[/SUB], B[SUB]6[/SUB] với hàm lượng từ một đến một vài mg/l. Chúng là thành phần coenzim của hàng loạt enzim xúc tác cho các phản ứng hoá sinh, vì vậy không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy.
*Myo-Inositol là một hợp chất thứ cấp có vòng thơm (chưa được xếp vào vitamin), do sù tham gia hình thành hợp chất pectin tạo thành tế bào, có tác động kích thích mạnh mẽ sự phân chia của tế bào, được sử dụng với lượng lớn ~ 100 mg/l.
5. Chất điều khiển sinh trưởng: Là thành phần quan trọng nhất của môi trường nuôi cấy, giúp điều khiển được quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào, thể hiện được tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật tách rời. Người ta thường sử dụng chủ yếu hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng thực vật sau:
- Auxin: kích thích quá trình tăng trưởng của tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo và rễ bất định. Các loại thường dùng là IAA(axit indolaxetic), αNAA(axit naphtyl axetic), IBA(axit indol butyric), 2,4DAA(axit Diclofenoxy axetic) Hàm lượng dùng nhỏ 10[SUP]-5[/SUP]-10[SUP]-7[/SUP] mol/l.
- Xytokinin: kích thích sự phân chia tế bào và tạo chồi bất định. Các loại thường dùng là Kinetin, BAP(6-benzylaminopurin), Zeatin, TDZ(Thidiazuron) với hàm lượng 10[SUP]-5[/SUP]-10[SUP]-7[/SUP] mol/l.
Người ta sử dụng phối hợp auxin và cytokinin với tỷ lệ và hàm lượng phù hợp để đạt mục đích mong muốn. Quy luật tương đối: tỷ lệ auxin trên xytokinin lớn thì các mẫu cấy tạo rễ bất định, tỷ lệ trung bình thì mẫu cấy tạo mô sẹo, còn tỷ lệ thấp thì tạo chồi.
Ngoài ra hợp chất Gibberillin có vai trò quan trọng trong sinh lý ngủ nghỉ của hạt, chồi, phát triển của hoa, tăng tưởng chiều dài thực vật, sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô phân sinh; các hợp chất ức chế sinh trưởng: axit absisic (ABA), CCC sử dụng trong bảo quản nguồn gen invitro.
5. Các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên: đây là thành phần thường dùng nhưng không bắt buộc trong môi trường nuôi cấy. Bao gồm nước dừa, dịch nghiền một số rau, củ, quả: khoai tây, chuối, táo, cà rốt dịch chiết nấm men, hợp chất cazein, pepton để gia tăng các chất dinh dưỡng, các chất có hoạt tính điều khiển sinh trưởng và sự phát triển của mẫu cấy.
6. Chất làm đông cứng môi trường: Là giá thể cho mẫu cấy. Thường dùng nhất là Agar agar. Đây là polysaccarit của tảo biển, hoà tan với nước khi ở nhiệt độ lớn hơn 80[SUP]0[/SUP]C thì ở dạng lỏng còn khi nhiệt độ nhỏ hơn 40[SUP]0[/SUP]C lại ở dạng rắn(gel). Agar có khả năng ngậm nước cao, chỉ cần 6-12 g có thể làm đông đặc 1l nước và khi ở trạng thái rắn thì tế bào và mô thực vật vẫn dễ dàng hấp thu được các chất dinh dưỡng từ môi trường.

III. Nguyên tắc, kỹ thuật chung trong nuôi cấy mô tế bào:

Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu khoa học đều thống nhất rằng thành công của nuôi cấy mô tế bào chỉ đạt được khi nó trải qua 5 bước sau:

Bước 0: Bước chuẩn bị
Chọn lọc cây mẹ đạt tiêu chuẩn sau:
- Cây mẹ có đặc điểm di truyền, đặc điểm nông, sinh học quý ta cần.
- Có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt.
- Sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus.
- Nếu trong tự nhiên không có những cây đạt tiêu chuẩn trên, phải trồng các cây mẹ trong điều kiện cách ly với nguồn bệnh hoặc tối ưu về điều kiện chăm sóc, dinh dưỡng, bảo vệ thực vật để có cây mẹ đạt tiêu chuẩn.

Bước 1: Nuôi cấy khởi động
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh mẫu nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy thường sử dụng trong phòng thí nghiệm là chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra, tuỳ thuộc từng đối tượng nuôi cấy người ta còn có thể sử dụng các mẫu nuôi cấy nh­mẩu lá, đài hoa, cánh hoa, mẩu rễ, phôi non.
Cần xác định chế độ khử trùng cho mẫu cấy trước khi tiến hành để đảm bảo mẫu sạch vi sinh vật nhưng tỉ lệ sống cao. Hiện nay sử dụng chủ yếu là phương pháp sát trùng bề mặt bằng chất hoá học, thường là HgCl[SUB]2[/SUB] 0,1% sát trùng trong 5-10 phót. Ýt phổ biến hơn là các dung dịch hypoclorit nh­ NaOCl, Ca(OCl)[SUB]2[/SUB] 5% trong 20-30 phót. Ngoài ra còn dùng H[SUB]2[/SUB]O[SUB]2 [/SUB]15%,dung dịch Brom 5-10% nhưng hiệu quả không cao.
Sau khi khử trùng mẫu cấy, ta tiến hành đưa mẫu cấy vào môi trường thích hợp để mẫu cấy tạo thành chồi mầm hoặc phôi vô tính. Việc lùa chọn môi trường thích hợp là rất khó khăn, cần phải đặc biệt chú ý đến tỷ lệ, hàm lượng các chất điều khiển sinh trưởng trong môi trường để làm cho mẫu cấy phát sinh được hình thái.

Bước 2: Nhân nhanh mẫu
Toàn bộ quá trình nuôi cấy mô tế bào xét cho cùng chỉ nhằm mục đích chính là tạo ra hệ số nhân chồi cao nhất. Chính vì vậy giai đoạn này được coi là giai đoạn đánh giá tính ưu việt hay không ưu việt của phương pháp nuôi cấy mô tế bào.
Ở giai đoạn này, môi trường dinh dưỡng nhân tạo để nuôi cấy thường được đưa thêm vào chất điều khiển sinh trưởng, các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết nâm men, dịch thuỷ phân casein .kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng nhằm đạt được hệ số nhân chồi cao nhất mà vẫn đảm bảo sức sống, bản chất di truyền, có thể tạo thành cây hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn cây giống ở giai đoạn sau . Tuy nhiên, tuỳ từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể đạt được hệ số nhân cao bằng việc kích thích sự hình thành các cụm chồi hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.

Bước 3: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được một kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường trong bước 2 vào môi trường tạo rễ. Thường sau 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ. ở giai đoạn này, người ta bổ sung vào môi trường các auxin vì auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Tuy nhiên, ở một số loài như chuối hoặc cây ngái sự hình thành rễ tốt hơn cả đạt được trong môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng.

Bước 4: Thích ứng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên
Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quy trình nuôi cấy mô tế bào.
Cây lấy ra ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc.Theo Bhojwani và Razdan(1983), quy trình này sẽ thành công hơn nếu trước khi đưa cây con ra đất ta ươm cây trên cát có độ Èm 90% từ 10 đến 15 ngày. Trong những khoảng thời gian này, rễ mới đượcc sinh ra và bắt đầu hình thành lá mới. Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thường.
Tuy nhiên vẫn còn một số các vấn đề tồn tại trong việc nuôi cấy mô tế bào.Đó là:
- Sự bất định di truyền
+ Khi sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống vô tính, có xảy ra hiện tượng biến dị soma: sù sai khác về hình thái, đặc điểm sinh lÝ, sinh hoá, di truyền của những cây tái sinh nhận được ở ngay giai đoạn invitro hoặc giai đoạn exvitro.
+ Khắc phục: Chọn mẫu cấy là mô non Ýt chuyên hoá để dễ điều khiển và phát triển hình thái, giảm lượng chất điều khiển sinh trưởng sử dụng, từ đó giảm được ảnh hưởng của chúng. Đồng thời, phải hạn chế số lần cấy chuyển khi nhân nhanh (5-6 lần), để giảm sự tích luỹ, gia tăng ảnh hưởng của các chát điều khiển sinh trưởng.
- Sự nhiễm mẫu cấy
+ Có một số vi sinh vật có khả năng xâm nhập và tồn tại rất sâu trong hệ thống mô dẫn của thực vật. Khi tế bào thực vật bắt đầu phát triển, phân chia, chúng làm nhiễm mẫu vào môi trường sau 2-3 tuần nuôi cấy.
+ Khắc phục: Chọn và nuôi trồng cây mẹ đúng tiêu chuẩn, nếu cây mẹ bị bệnh có thể dùng kháng sinh để khử trùng mẫu
- Sự tiết độc tố từ mẫu cấy
+ Sau 1-2 ngày đưa vào môi trường, mẫu cấy tiết ra những chất màu đen, nâu làm háng môi trường, chết mẫu. Các chất đó có thể là tanin, polyphenol bị oxy hoá.
+ Khắc phục: Chọn mẫu non để giảm hàm lượng tanin, polyphenol ; gây vết thương cơ giới tối thiểu nhất; xử lý mẫu cấy bằng cách ngâm trong dung dịch axit hữu cơ có tính khử mạnh: axit ascorbic, axit xitric; bổ sung vào môi trường than hoạt tính để hấp phụ các chất nói trên.
- Hiện tượng thuỷ tinh hoá mẫu cấy
+ Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng và bình nuôi bị hạn chế về khả năng trao đổi khí thì tế bào và mô thực vật bị mọng nước, trở nên trong suốt, có hình dạng không bình thường
+ Khắc phục: Bổ sung vào môi trường chất gây áp suất cao, chất ức chế tổng hợp etilen, tăng cường độ chiếu sáng và giảm nhiệt độ phòng nuôi .