Báo Cáo Nghiên cứu bệnh do Phytoplasma hại tre luồng và biện pháp phòng trừ

BÁO CÁO TỔNG KẾT
THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ
NĂM 2010


PHẦN I: MỞ ĐẦU .1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu của đề tài 3
3. Nội dung nghiên cứu chính .3


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4
2.1. Lịch sử nghiên cứu Phytoplasma .4
2.2. Hình thái Phytoplasma .5
2.3. Tầm quan trọng của Phytoplasma 5
2.4. Phân loại Phytoplasma .6
2.5. Hình thái của Phytoplasma .8
2.6. Triệu chứng bệnh do phytoplasma .8
2.7. Lan truyền .9
2.8. Chẩn đoán .9
2.9. Phòng chống .10
2.10. Nghiên cứu bệnh Phytoplasma trên cây họ tre nứa .10
2.12. Nghiên cứu bệnh Phytoplasma ở Việt Nam .12
2-13. Nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh sọc tím luồng .12


PHẦN III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 14
3.1 Phương pháp điều tra xác định mức độ nhiễm bệnh 14
3.2 Phương pháp thu mẫu bệnh hại 14
3.3 Phương pháp phân lập mẫu (Doungporn Morakotkarn, 2006) .14
3.4 Phương pháp chiết DNA 15
3.5 Phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) xác định Phytoplasma, vi khuẩn .16
3.6 Phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) xác định nấm. 18
3.7 Chạy điện di trên gel agarose để kiểm tra sản phẩm PCR. .19
3.8 Nhân dòng sản phẩm PCR trong vi khuẩn E.coli .20
3.9 Giải trình tự DNA .20
3.10 Phân tích trình tự 20
3.11 Phương pháp lây bệnh nhân tạo .20
3.12 Thí nghiệm phòng trừ 20


PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. .22
CHƯƠNG 1. ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH BỆNH, ĐIỀU TRA, THU THẬP MẪU BỆNH CÁC BỆNH GIỐNG BỊ NHIỄM HYTOPLASMA .23
4 Triệu chứng các bệnh giống như nhiễm Phytoplasma .23
4.2 THU THẬP MẪU BỆNH .30
4.3 MỨC ĐỘ PHỔ BIẾN CỦA CÁC BỆNH .31
4.3.1 Bệnh lá nhỏ tre, chổi phù thủy tre cảnh và trúc quân tử 31
4.3.2 Bệnh lá nhỏ hại luồng .32
4.3.3 Bệnh chổi sể và sọc tím 32
4.4 ĐÁNH GIÁ TÁC HẠI CỦA BỆNH SỌC TÍM .34
4.4.1 Sự phát triển của bệnh sọc tím theo thời kỳ sinh trưởng của cây 34
4.4.2 Ảnh hưởng bệnh sọc tím đến kích thước thân cây luồng .35


CHƯƠNG 2. XÁC ĐỊNH NGUYÊN NHÂN PHYTOPLASMA. .38
4.5 ĐIỀU TRA VECTOR TRUYỀN BỆNH .38
4.5.1 Xác định vector truyền bệnh 38
4.5.2 Điều tra vị trí cư trú của rầy nâu vằn .39
4.6 PHÁT HIỆN PHYTOPLASMA LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH .40
4.6.1 Chọn lọc và thiết kế các cặp mồi chẩn đoán phytoplasma. .40
4.6.2 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi U3/U5 44
4.6.3 Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR (U3/U5) .46
4.6.4 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi P1/P7 (kết hợp với Nested – PCR) .49
4.6.5 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi SN01119 / SN910601 .52
4.6.6 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi SN910601/P7 54
4.6.7 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi U5/Phy1R .58
4.6.8 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi Phy1F/Spacer1R và cặp mồi Phy1F/Phy1R .59
4.6.9 Kiểm tra PCR với cặp mồi Phy1F/Spacer2R và Phy1F/Spacer3R 64
4.6.10 Dòng hóa và giải trình tự 73
4.6.11 Thảo luận kết quả phát hiện Phytoplasma .78


CHƯƠNG 3. XÁC ĐỊNH NẤM liên quan đẾN BỆNH .80
4.7 PHÂN LÂP NẤM .80
4.7.1 Bệnh sọc tím luồng .80
4.7.2 Bệnh chổi sể .82
4.7.3 Bệnh cựa gà 85
4.8 XÁC ĐỊNH NẤM BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG RNA RIBOSOME 87
4.8.1 Lựa chọn mồi và vùng gien nghiên cứu .87
4.8.2 Phản ứng PCR 87
4.8.3 Nhân dòng sản phẩm PCR các mẫu nấm trong vi khuẩn E.coli .90
4.8.4 Giải trình tự mẫu nấm được nhân bởi cặp mồi ITS4/ITS5 91
4.8.5 Thảo luận kết quả phát hiện và xác định nấm 94


CHƯƠNG 4. XÁC ĐỊNH VI KHUẨN LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH SỌC TÍM .99
4.9 PHÂN LẬP VI KHUẨN .99
4.10 XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG MÃ HÓA RNA RIBOSOME 100
4.10.1 PCR và dòng hóa 100
4.10.2 Giải trình tự 100


CHƯƠNG 5. LÂY NHIỄM NHÂN TẠO VÀ THÍ NGHIỆM PHÒNG TRỪ BỆNH SỌC TÍM .103
4.11 LÂY NHIỄM NHÂN TẠO .103
4.12 THÍ NGHIỆM PHÒNG TRỪ .104
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 107
5.1. Kết luận 107
5.2. Đề nghị .109


PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 110

PHẦN I: MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam là một trong các quốc gia có diện tích cây họ tre nứa lớn và mức độ đa dạng cao. Cây họ tre nứa thuộc họ hòa thảo (Poaceae). Theo thống kê, có khoảng 1250 loài thuộc 75 chi trên toàn thế giới. Việt Nam ước tính có 216 loài thuộc 25 chi (Nguyễn Hoàng Hộ, 2005). Tổng diện tích cây họ tre nứa năm 2004 khoảng 1,6 triệu ha, trong đó 800,000 ha rừng tự nhiên thuần loài, 700.000 ha rừng tự nhiên hỗn loài và 100.000 ha rừng trồng (Nguyễn Ngọc Bình và Phạm Đức Tuấn, 2007).
Ở Việt Nam, ngoài ý nghĩa văn hóa, nhiều loài cây họ tre nứa còn có giá trị kinh tế lớn như tre, nứa, bương và đặc biệt là luồng. Cây luồng (Dendrocalamus membranaceous) được trồng để lấy măng, nguyên liệu cho xây dựng, sản xuất đồ mỹ nghệ và chế biến giấy. Cây luồng được trồng ở nhiều nơi nhưng đặc biệt nhiều tại tỉnh Thanh Hóa. Tại tỉnh này, luồng là 1 trong những cây lâm nghiệp chiến lược, cây xóa đói giảm nghèo. Năm 2006, diện tích luồng của tỉnh lên tới 69,000 ha , tập trung tại 3 huyện Quan Hóa, Lang Chánh và Ngọc Lặc. Hiện nay, cây luồng bị một số bệnh tấn công trong đó đặc biệt nghiêm trọng là các bệnh sọc tím. Ngoài ra, một số bệnh khác cũng công bố thấy trên luồng tại Thanh Hóa là bệnh chổi xể (chổi phù thủy) và bệnh lá nhỏ. Bệnh sọc tím mới xuất hiện vài năm tại các khu vực trồng luồng tại Thanh Hóa nhưng ảnh hưởng đáng kể đến năng suất, chất lượng luồng. Đối với bệnh sọc tím, các triệu chứng chính của bệnh là măng mọc nhiều từ gốc cây con (trên một tuổi) và mọc thành chùm trên đốt cây trưởng thành cách mặt đất 1-2 m và ngừng sinh trưởng khi đạt chiều cao khoảng 20-30cm; cây măng mọc từ đất có thể đạt 5-6 m nhưng đường kính giảm mạnh. Đặc biệt trên thân măng có các sọc tím chạy từ các đốt phía dưới lên trên. Cây bị bệnh khoảng 2-3 năm rất còi cọc. Trên cây bệnh, lá mọc ít và nhỏ.


Vì các bệnh trên có triệu chứng khá giống với triệu chứng do Phytoplasma gây ra nên năm 2007, một nghiên cứu thăm dò nhằm xác định nguyên nhân gây bệnh đã được thực hiện. Trong nghiên cứu này, Vũ Triệu Mân và ctv (2007) đã sử dụng kỹ thuật quan sát lát cắt siêu mỏng mô bệnh dùng kính hiển vi điện tử và PCR dùng một cặp mồi đặc hiệu gen mã hóa RNA ribosome nhằm kiểm tra sự có mặt của Phytoplasma trên 2 mẫu luồng bị bệnh sọc tím. Nghiên cứu cho thấy (i) sự có mặt của các thể vô định hình trong tế bào mẫu bệnh và (ii) phản ứng PCR dương tính đối với mẫu DNA chiết từ mô cây bệnh. Dựa trên các kết quả này, các tác giả cho rằng nguyên nhân gây bệnh sọc tím tại Thanh Hóa có lẽ do một Phytoplasma gây ra.
Phytoplasma là loại vi khuẩn đặc biệt không thể nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo. Vì vậy, các nghiên cứu xác định nguyên nhân thường dựa vào các công cụ chẩn đoán sinh học phân tử. Hơn nữa triệu chứng do phytoplasma gây ra thường liên quan tới sự mất cân bằng phytohormone của cây, một hiện tượng cũng có thể do một số đối tượng khác như nấm, vi khuẩn, virus và nhện hại gây ra nên việc chẩn đoán bệnh nhìn chung phức tạp.
Nhằm xác định chính xác tác nhân gây bệnh giống bị nhiễm Phytoplasma trên cây họ tre nứa, đặc biệt là luồng, làm cơ sở khoa học cho việc áp dụng các biện pháp phòng chống, được sự phê duyệt của Liên hiệp các Hội Khoa học và Kỹ thuật Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu bệnh do Phytoplasma hại tre luồng và biện pháp phòng trừ”


2. Mục tiêu của đề tài
Đề tài nhằm xác định tác nhân gây bệnh giống bị nhiễm Phytoplasma trên tre luồng và đề xuất biện pháp kiểm soát bệnh.
3. Nội dung nghiên cứu chính
1. Điều tra, thu thập bệnh giống bị nhiễm Phytoplasma trên cây họ tre nứa, tập trung bệnh trên luồng tại Thanh Hóa và một số tỉnh miền Bắc.
2. Đánh giá tình hình bệnh sọc tím, bệnh luồng lá nhỏ, chổi phù thuỷ trên luồng tại Thanh Hoá.
3. Xác định nguyên nhân gây bệnh sọc tím, lá nhỏ, chổi phù thuỷ, tập trung vào đối tượng phytoplasma.
4. Xác định vector và phương thức truyền bệnh do phytoplasma
5. Thử nghiệm và đề xuất biện pháp phòng trừ bệnh do phytoplasma