Thạc Sĩ Nghiên cứu ảnh hưởng bổ sung tế bào và hormone lên sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm

LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NĂM 2012

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN . ii
MỤC LỤC . iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN vi
DANH MỤC CÁC HÌNH vii
MỞ ĐẦU . 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu của đề tài . 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Sự hình thành và phát triển phôi in vivo . 3
1.1.1. Sự thụ tinh 3
1.1.2. Quá trình thụ tinh 4
1.1.3. Những yếu tố đảm bảo xảy ra sự thụ tinh . 5
1.1.4. Sự phát triển của phôi in vivo . 6
1.1.5. Sự làm tổ của phôi 8
1.2. Các yếu tố ảnh hưởng lên sự phát triển của phôi in vitro . 9
1.2.1. Thụ tinh trong ống nghiệm . 9
1.2.2. Buồng trứng 10
1.2.3. Loại nang trứng . 11
1.2.4. Quá trình nuôi thành thục trứng và các hormone bổ sung 12
1.2.5. Hệ thống nuôi phôi 13
1.3. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 19
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 21
2.1. Đối tượng nghiên cứu 21
2.2. Địa điểm nghiên cứu . 21
2.3. Vật liệu nghiên cứu . 21
2.3.1. Dụng cụ, thiết bị 21
2.3.2. Hóa chất, môi trường 22
2.4. Phương pháp nghiên cứu . 23
2.4.1. Phương pháp thu, bảo quản và vận chuyển buồng trứng 23
2.4.1.2. Phương pháp phân loại phẩm chất trứng 23
2.4.2. Phương pháp thu tế bào nguyên bào sợi phôi chuột (Mouse Embryonic Fibroblast- MEF) 25
2.4.3. Phương pháp thu cụm tế bào màng trong ống dẫn trứng . 27
2.4.4. Phương pháp nuôi phôi và đánh giá sự phát triển của phôi 28
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu . 30
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. Kết quả nhân nuôi tế bào nguyên bào sợi từ bào thai chuột . 31
3.2. Nghiên cứu phân lập, nhân nuôi tế bào màng trong ống dẫn trứng 34
3.2.1. Kết quả thu tế bào màng trong ống dẫn trứng . 34
3.2.2. So sánh ảnh hưởng thời gian quay của cụm tế bào lên chất lượng của cụm tế bào thu được và cụm tế bào sau giải đông 36
3.3. Kết quả bổ sung hormone lên tỷ lệ trứng thành thục 37
3.4. Kết quả nuôi phôi từ các hệ thống môi trường . 39
3.4.1. Hệ thống 1 (HT1) 39
3.4.2. Hệ thống 2 (HT2) 40
3.4.3. Hệ thống 3 (HT3) 41
3.4.4. Hệ thống 4 (HT4) 43
3.5. So sánh kết quả tạo phôi từ các hệ thống 44
3.5.1. So sánh tỷ lệ tạo phôi từ hệ thống 1, hệ thống 2 và hệ thống 3 . 44
3.5.2. So sánh tỷ lệ tạo phôi từ hệ thống 2 và hệ thống 4 . 45
3.5.3. So sánh tỷ lệ tạo phôi từ hệ thống 1, 2, 3 và hệ thống 4 . 46
KẾT LUẬN . 49
KIẾN NGHỊ 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 51
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 58

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngày nay, công nghệ sinh học nói chung và công nghệ sinh học sinh sản nói riêng đã rất phát triển và đạt nhiều thành tựu quan trọng, đem lại nhiều ý nghĩa và lợi ích thiết thực trong cuộc sống. Một trong những thành tựu nổi bật nhất của công nghệ sinh học là sự kiện nhân bản vô tính thành công (1997) với sự ra đời của cừu Dolly. Còn trong sinh sản hữu tính thành tựu quan trọng nhất là tạo phôi trong ống nghiệm, phôi là nguồn vật liệu quan trọng trong chuyển cấy phôi tạo nguồn động vật đồng loạt, phục vụ cho các thử nghiệm trong y học, hoặc nhằm mục đích nâng cao năng suất vật nuôi trong chăn nuôi. Nước ta là nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển, song cũng là một điểm nóng về bảo vệ đa dạng sinh học nói chung và nguồn gen các giống lợn nói riêng. Trong vòng đời sinh sản của một con vật, chu kỳ sống của chúng có loài chỉ sinh ra 4-5 con cái thông qua sinh sản bình thường, trong khi thông qua thụ tinh ống nghiệm có thể tạo ra 50-80 con cái trong chu kỳ sống của chúng. Vì vậy thụ tinh ống nghiệm giữ vai trò quan trọng trong việc tạo ra nhiều động vật với số lượng lớn và đặc tính gen cũng sẽ được cải thiện đáng kể.
Kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm trên động vật nói chung và kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm trên lợn nói riêng đã có nhiều nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển phôi, nhưng vấn đề quan tâm nhiều nhất đó là việc nghiên cứu bổ sung, thay thế các chất khác nhau vào các môi trường cơ bản ban đầu. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng có lợi của đồng nuôi cấy đến sự phát triển của phôi như cải thiện chất lượng phôi, tăng tỷ lệ phát triển của phôi vào giai đoạn phôi nang [32], [64]. Bổ sung môi trường nuôi cấy với tế bào đệm như tế bào màng trong ống dẫn trứng là yếu tố tăng cường sự phát triển của phôi lợn trong ống nghiệm [14], [48]. Các nguyên bào sợi phôi chuột đã được sử dụng trong đồng nuôi cấy, nguyên bào sợi phôi chuột tiết ra các yếu tố nhằm nâng cao sự phát triển của phôi, cho kết quả tốt đối với sự phát triển của phôi bò và cừu [36], [47]. Cho đến nay các vấn đề về việc nghiên cứu môi trường tối ưu để có chất lượng phôi phát triển tốt đã được cải thiện phần nào. Ở Việt Nam, việc nuôi thành thục và thụ tinh ống nghiệm các trứng lợn đã được thực hiện từ những năm đầu của thế kỷ 21 [3], [6]. Một số nghiên cứu đã được tiến hành trên đối tượng trứng và phôi lợn in vitro [4] [7], [9]. Tuy nhiên tỷ lệ thành thục của trứng và tỷ lệ tạo phôi vẫn còn thấp so với tỷ lệ chung trên thế giới. Nguyên nhân của hiện tượng này vẫn chưa được làm sáng tỏ. Việc nghiên cứu cải thiện hệ thống nuôi phôi in vitro bằng cách bổ sung các loại tế bào đệm như nguyên bào sợi thai chuột hay tế bào màng trong ống dẫn trứng nhằm nâng cao chất lượng phát triển cho các phôi động vật nói chung và phôi lợn nói riêng là cần thiết cho việc ứng dụng công nghệ này trong nghiên cứu và sản xuất. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng bổ sung tế bào và hormone lên sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm’’.

2. Mục tiêu của đề tài
- Đánh giá được ảnh hưởng của việc bổ sung hormone, bổ sung tế bào màng trong ống dẫn trứng và nguyên bào sợi thai chuột vào môi trường nuôi phôi lên kết quả thụ tinh ống nghiệm ở lợn.
- Thu nhận được các kết quả thí nghiệm cần thiết về sản xuất và bảo quản tế bào, chế độ bổ sung tế bào nhằm góp phần nâng cao hiệu quả thụ tinh ống nghiệm ở lợn.
3. Nội dung nghiên cứu
- Thu trứng, nuôi thành thục trứng in vitro trong môi trường cơ bản và môi trường có bổ sung hormone.
- Thu và nhân nuôi tế bào màng trong ống dẫn trứng từ ống dẫn trứng lợn.
- Thu và nhân nuôi tế bào nguyên bào sợi từ bào thai chuột.
- Nuôi phôi trong môi trường cơ bản, môi trường có bổ sung tế bào màng vòi trứng và nguyên bào sợi phôi chuột.