Tiến Sĩ Một số đặc điểm vi rút học của vi rút cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt Nam, 2009 - 2013

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NĂM 2015
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I – TỔNG QUAN . 3
1.1. Vi rút cúm . 3
1.1.1. Đặc điểm vi rút học . 3
1.1.2. Quá trình nhân lên của vi rút cúm A . 10
1.2. Đại dịch cúm A/H1N1/09 13
1.2.1. Tình hình cúm A(H1N1)pdm09 trên thế giới . 13
1.2.2. Phản ứng của TCYTTG trước diễn biến của đại dịch A/H1N1/09 19
1.2.3. Tình hình đại dịch cúm A/H1N1/09 tại Việt Nam 20
1.2.4. Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 . 21
1.3. Các phương pháp chẩn đoán vi rút cúm A(H1N1)pdm09 PTN 24
1.3.1. Phân lập vi rút. 24
1.3.2. Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền . 26
1.3.3. Phương pháp phát hiện kháng thể . 30
1.4. Vắc xin . 32
1.4.1. Các loại vắc xin cúm . 33
1.4.2. Đáp ứng miễn dịch của vắc xin cúm . 37
1.4.3. Phản ứng phụ của vắc xin cúm mùa và cúm đại dịch . 38
1.4.4. Lựa chọn chủng vi rút dự tuyển vắc xin . 38
CHƯƠNG II – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41
2.1. Đối tượng nghiên cứu . 41
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu . 41
2.1.2 . Tiêu chuẩn lựa chọn chủng cúm A(H1N1)pdm09 . 41
2.2. Phương pháp nghiên cứu: 41
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: 41
2.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: 41
2.2.3. Cỡ mẫu trong nghiên cứu 42
2.2.4. Các biến số nghiên cứu . 42
2.2.5. Vật liệu và kĩ thuật xét nghiệm . 43
2.2.6. Trang thiết bị và dụng cụ tiêu hao 60
2.3. Vấn đề Y đức trong nghiên cứu . 60
CHƯƠNG III – KẾT QUẢ 61
3.1. Lựa chọn chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu 61
3.2. Kết quả PCR phân tách và khuếch đại 6 phân đoạn gen 62
3.2.1. Đặc điểm di truyền gen HA(Haemagglutinin) 63
3.2.2. Đặc điểm di truyền gen NA(Neuraminidase). 69
3.2.3. Đặc điểm di truyền các gen M, NS, PB1 và PB2. 74
3.3. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 84
3.3.1. Kết quả thử nghiệm HI trên các vi rút phân lập trong nghiên cứu. 84
3.3.2. Phân bố sự thay đổi đặc tính kháng nguyên theo thời gian và các thay
đổi axit amin trong protein HA liên quan. 85
3.4. Các đột biến liên quan đến thay đổi đặc điểm kháng nguyên hoặc giảm độ
nhạy cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir. 86
3.4.1. Phát hiện đột biến bằng phân tích trình tự nucleotide 87 3.4.2. Kết quả thử nghiệm sinh học đánh giá ảnh hưởng của đột biến đến
biểu hiện kiểu hình của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 89
3.5. Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin 90
3.6. Thử nghiệm ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin Assay –HA) 93
CHƯƠNG IV – BÀN LUẬN 95
4.1. Sự lưu hành của cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, 2009 -2013 95
4.2. Lựa chọn vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu. 96
4.3. Kết quả phân tách, khuếch đại và giải trình tự 6 phân đoạn gen . 97
4.4. Kết quả phân tích cây gia hệ HA, NA, M, NS, PB1 và PB2 . 98
4.5. Kết quả phân tích protein HA, NA, M1, M2 , NS1, NS2, PB1, PB2 101
4.5.1 . Protein HA . 101
4.5.2 . Protein NA. 106
4.5.3 . Các protein M1, M2 , NS1, NS2, PB1 và PB2 108
4.6. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 109
4.7. Kết quả thử nghiệm ức chế neuraminidase (NAI). 112
4.8. Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin 113
KẾT LUẬN 118
KIẾN NGHỊ . 120
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 được phát hiện lần đầu tiên vào đầu tháng 3
năm 2009 tại Mexico nhanh chóng lan rộng ra phạm vi toàn cầu và đã phát triển
thành đại dịch cúm đầu tiên của thế kỷ 21[80], [109]. Theo số liệu thống kê của
TCYTTG, ngày 06/08/2010 đại dịch cúm đã lan rộng 214 quốc gia và vùng lãnh
thổ, gây tử vong cho 18.449 trường hợp [120], [121]. Tương tự các đại dịch cúm
đã xảy ra ở giai đoạn trước, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tiếp tục lưu hành cùng
với các vi rút cúm A/H3N2 và vi rút cúm B gây ra các dịch cúm mùa hàng năm
[109], [119].
Việt Nam là nước thứ 54 trên thế giới thông báo các trường hợp nhiễm vi
rút cúm A(H1N1)pdm09, trường hợp nhiễm đầu tiên được ghi nhận vào ngày
31/5/2009 [2]. Dịch cúm bắt đầu lan rộng trong cộng đồng vào tháng 7/2009 và
trong giai đoạn tháng 8 đến tháng 9/2009 có 85 – 95% tổng số các trường hợp
nhiễm cúm được ghi nhận tại Việt Nam là căn nguyên do cúm A(H1N1)pdm09.
Theo thống kê của Bộ Y tế, tổng số 11.104 trường hợp nhiễm với 53 trường hợp
tử vong báo cáo tại Việt Nam (28/12/2009) [4].
Trong giai đoạn 2010 – 2013, theo số liệu của chương trình giám sát cúm
quốc gia (NISS) tại các điểm nghiên cứu vi rút cúm A(H1N1)pdm09 được ghi
nhận với tỷ lệ là 46,6 % trong tổng số các trường hợp nhiễm vi rút cúm năm



2009 và giảm với tỷ lệ 28 % trong năm 2010 khi có sự đồng lưu hành của vi rút
cúm A/H3N2. Tại năm 2011, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tiếp tục gây dịch với tỷ
lệ 74,1% và đạt 30% trong năm 2013. Kể từ khi xuất hiện đại dịch cúm năm
2009 và tiếp tục trong gây dịch các năm tiếp theo, những phân tích về di truyền
học đã phát hiện một số thay đổi (đột biến) liên quan đến sự đa dạng của biểu
hiện lâm sàng, độc lực và đáp ứng miễn dịch [8], [22].
Những sự thay đổi được ghi nhận như tăng tiến triển viêm phổi nặng, có thể
gây tử vong liên quan đến sự thay đổi của axit amin tại vị trí 222 trên protein HA
(D222/G/E/N), đột biến I129K tại khu vực thụ cảm thể bám trên gai HA sẽ làm tăng ái lực gắn bám của vi rút vào tế bào biểu mô đường hô hấp [8], [11]. Các
đột biến I117V, I223R và H275Y trên protein NA là nguyên nhân của hiện
tượng vi rút giảm độ nhạy hoặc kháng thuốc oseltamivir cũng được ghi nhận
[68], [71]. Ngoài ra, một số thay đổi trên các protein NP, PA và PB2 đã ảnh
hưởng tới độc tính của vi rút hoặc làm tăng khả năng nhân lên của vi rút trong tế
bào chủ. Hơn thế nữa, khả năng tiềm tàng của hiện tượng trao đổi và tích hợp
(reassortment) của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với các vi rút cúm A khác có thể
sẽ tăng độc tính hoặc nguy cơ tạo ra một vi rút cúm mới [5], [14], [18].
Hiện tại, vắc xin cúm mùa thương mại có khả năng phòng nhiễm vi rút cúm
A(H1N1)pdm09 và các thông tin về dịch tễ học, vi rút học vẫn được yêu cầu cập
nhật thường xuyên trong hệ thống giám sát cúm toàn cầu (GISRS) của
TCYTTG. Tại Việt Nam, vắc xin phòng chống cúm mùa đang được phát triển tại
một số đơn vị sản xuất vắc xin và sử dụng các vi rút dự tuyển theo khuyến cáo
của TCYTTG, trong khi đó một số nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc,
Australia lựa chọn các vi rút cúm lưu hành tại nước mình để phát triển vắc xin để
đảm bảo sự tương đồng cao về di truyền, đặc tính kháng nguyên nâng cao hiệu
quả cao của vắc xin phòng bệnh [24], [39], [117].
Để chủ động trong công tác phòng chống cúm đồng thời góp phần vào
chiến lược phát triển vắc xin cúm tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu
“Một số đặc điểm vi rút học của vi rút cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt
Nam, 2009 – 2013” với các mục tiêu:
1. Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09
lưu hành tại Việt Nam giai đoạn 2009 – 2013.
2. Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09.
3. Đề xuất chủng vi rút dự tuyển cho vắc xin phòng cúm A(H1N1)pdm09 tại
Việt Nam.