Luận Văn Luận Án Tiến sĩ sinh học: Tạo dòng chịu hạn và phân lập gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở c

LUẬN ÁN dài 146 Trang có File WORD

MỤC LỤC

Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt vi
Danh mục bảng viii
Danh mục hình x
MỞ ĐẦU . 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Cây lạc và đặc tính chịu hạn của cây lạc . 4
1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm nông sinh học của cây lạc . 4
1.1.2. Đặc tính chịu hạn của thực vật và của cây lạc . 8
1.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng chịu hạn của cây trồng bằng công nghệ tế bào thực vật . 15
1.2.1. Chọn dòng tế bào soma trong chọn giống cây trồng 16
1.2.2. Phát sinh biến dị trong quá trình nuôi cấy . 19
1.2.3. Các phương pháp chọn dòng tế bào . 20
1.2.4. Một số thành tựu trong chọn dòng chống chịu yếu tố bất lợi của
ngoại cảnh . 21
1.3. Phân tích, đánh giá các dòng chọn lọc có nguồn gốc từ nuôi cấy
mô sẹo 23
1.3.1. Đánh giá khả năng chịu mất nước của mô, tế bào thực vật . 23
1.3.2. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm và giai đoạn
cây non 24
1.3.3. Kỹ thuật RAPD trong đánh giá hệ gen của các dòng chọn lọc 26
1.4. Gen liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc 28

1.4.1. Các gen liên quan đến khả năng chịu hạn của cây lạc . 28
1.4.2. Nhóm gen mã hóa protein điều khiển hoạt động phiên mã của các
gen chịu hạn . 29
1. 5. Cystatin và vai trò của cystatin ở thực vật 30
1.5.1 Đặc điểm cấu tạo và phân loại cystatin 30
1.5.2. Cấu trúc không gian và cơ chế ức chế của cystatin . 33
1.5.3. Chức năng của cystatin . 37
1.5.4. Gen mã hóa cystatin . 38

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43

2.1. Vật liệu thực vật 43
2.2. Hoá chất và thiết bị . 45
2.3. Phương pháp nghiên cứu . 45
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro . 46
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu đồng ruộng 49
2.3.3. Phương pháp sinh lý, hoá sinh . 50
2.3.4. Phương pháp sinh học phân tử . 52
2.3.5. Phương pháp phân tích số liệu . 55
2.4. Địa điểm nghiên cứu . 56

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . 57
31. Kết quả tạo dòng chịu hạn bằng kỹ thuật xử lý mô sẹo trong hệ
thống nuôi cấy in vitro . 57
3.1.1 Sàng lọc dòng mô sẹo chịu tác động của thổi khô 57
3.1.2 Ảnh hưởng của tia gamma kết hợp với thổi khô đến tỷ lệ sống sót
và tái sinh cây của giống lạc L18 . 66
3.1.3 Đặc điểm nông sinh học của các quần thể lạc ở thế hệ R0 và RM0 . 69
3.2. Kết quả phân tích những dòng lạc chọn lọc qua các thế hệ . 74
3.2.1. Đặc điểm nông sinh học các dòng lạc chọn lọc ở thế hệ thứ Nhất
và thứ Ba 74
3.2.2. Đánh giá các dòng chọn lọc ở thế hệ thứ Năm . 78
3.2.3. Đặc điểm của một số dòng lạc ưu việt . 94
3.3. Phân lập và xác định trình tự gen cystatin từ cây lạc 97
3.3.1. Khuyếch đại gen cystatin từ DNA hệ gen của cây lạc . 97
3.3.2. Kết quả tách dòng và xác định trình tự gen cystatin . 98
3.3.3. Kết quả so sánh trình tự gen và protein cystatin 102
KẾT LUẬN . 111
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 113
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 114
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG


Bảng 1.1. Diện tích, năng suất và sản lượng lạc của Việt Nam giai
đoạn 2005-2009 . . 5
Bảng 1.2. Gen cystatin liên quan với khả năng chống chịu hạn ở
một số loài thực vật . 41
Bảng 2.1. Một số đặc điểm của 10 giống lạc nghiên cứu 43
Bảng 3.1. Tỷ lệ tạo mô sẹo và khối lượng mô sẹo của 10 giống lạc 58
Bảng 3.2. Độ mất nước của mô sẹo sau xử lý bằng kỹ thuật thổi khô 59
Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra khả năng chịu mất nước của mô sẹo 10
giống lạc bằng phương pháp nhuộm TTC 61
Bảng 3.4. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo bị xử lý bằng thổi khô sau 4
tuần nuôi phục hồi 63
Bảng 3.5. Tỷ lệ tái sinh cây của mô sẹo sống sót sau 6 tuần 65
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của chiếu xạ kết hợp với thổi khô 9 giờ đến
tỷ lệ sống sót và tái sinh cây của mô sẹo ở giống lạc L18 66
Bảng 3.7. Đặc điểm nông học của quần thể R0, RM0 tái sinh từ mô
sẹo mất nước . . 70
Bảng 3.8. Đặc điểm nông sinh học các dòng lạc chọn lọc ở thế hệ
thứ Nhất . 75
Bảng 3.9. Đặc điểm nông học các dòng lạc chọn lọc thế hệ thứ Ba 77
Bảng 3.10. Đặc điểm nông sinh học và chất lượng hạt các dòng
chọn lọc ở thế hệ thứ Năm . 79
Bảng 3.11. Tương quan giữa hoạt độ của -amylase và hàm lượng
đường ở giai đoạn hạt nảy mầm . 84
Bảng 3.12. Tỷ lệ cây sống, cây phục hồi và chỉ số chịu hạn tương
đối của các dòng chọn lọc ở thế hệ thứ Năm 86
Bảng 3.13. Số phân đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên và tỷ lệ phân
đoạn đa hình của 25 mồi trong phản ứng RAPD . 90
Bảng 3.14. Tỷ lệ sai khác về hệ gen của các dòng chọn lọc và giống
gốc L18 . 91
Bảng 3.15. Chỉ thị RAPD đặc trưng của các dòng lạc chọn lọc 93
Bảng 3.16. Một số đặc điểm của 3 dòng chọn lọc và giống L18 95
Bảng 3.17. Sự sai khác về trình tự nucleotide trên gen cystatin của
giống và dòng lạc nghiên cứu . 103
Bảng 3.18. Độ tương đồng và độ sai khác đoạn mã hoá một số trình
tự gen cystatin . 104
Bảng 3.19. Thành phần amino acid của protein cystatin ở cây lạc 109


DANH MỤC HÌNH


Hình 1.1. Trình tự 102 amino acid của OCI . . 32
Hình 1.2. Cấu trúc không gian ba chiều của cystatin thực vật 34
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc ức chế hoạt động của oryzacystatin . 36
Hình 2.1. Mô hình thí nghiệm tổng quát . 46
Hình 3.1. Độ mất nước của mô sẹo các giống lạc . 60
Hình 3.2. Dung dịch nhuộm TTC của mô sẹo giống lạc L18 ở các ngưỡng xử lý thổi khô . 62
Hình 3.3. Một số hình ảnh cây tái sinh của giống lạc L18 ở giai đoạn
6 tuần tuổi . . 68
Hình 3.4. Các dòng lạc chọn lọc trồng ở vụ xuân 2008 70
Hình 3.5. Hình ảnh trong chọn dòng chịu hạn ở lạc bằng kỹ thuật 72 nuôi cấy in vitro
Hình 3.6. Sự biến động về hoạt độ của -amylase trong điều kiện
hạn sinh lý 81
Hình 3.7 Sự biến động hàm lượng đường trong điều kiện hạn sinh lý 83
Hình 3.8 Đồ thị hình rada biểu thị sự khác nhau về khả năng chịu
hạn của các dòng lạc chọn lọc, giống L18 và giống L23 87
Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với một số mồi 89
Hình 3.10. Sơ đồ mô tả mối quan hệ của 7 dòng chọn lọc với giống
gốc L18 ở mức phân tử 92
Hình 3.11. Hình ảnh quả và hạt của các dòng chọn lọc ở thế hệ thứ
Năm . . 96
Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm nhân gen cystatin từ cây lạc . 97
Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR . 99
Hình 3.14. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen cystatin của cây lạc 102
Hình 3.15. Mối quan hệ di truyền của một số đoạn mã hoá gen cystatin thực vật . 105
Hình 3.16. So sánh trình tự amino acid của 4 mẫu nghiên cứu . 107


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây thực phẩm, cây công nghiệp lấy dầu trong nhóm cây trồng cạn. Mặc dù cây lạc đã có từ lâu đời nhưng vai trò của cây lạc mới được công bố từ khoảng 100 năm trở lại đây. Trồng lạc mang lại nguồn lợi có giá trị về kinh tế, về dinh dưỡng, đồng thời còn để cải tạo đất rất tốt nhờ khả năng cộng sinh với vi khuẩn Rhizobium [3]. Trên thế giới, nhu cầu sử dụng và tiêu thụ lạc ngày càng tăng, đó cũng là lý do khuyến khích nhiều nước đầu tư phát triển sản xuất lạc với quy mô liên tục mở rộng [145].
Ở Việt Nam, sản xuất lạc được phân bố trên tất cả các vùng sinh thái nông nghiệp, với khoảng 40% tổng diện tích gieo trồng các cây công nghiệp ngắn ngày. Trong đó, 2/3 diện tích đất trồng lạc phụ thuộc vào nước trời. So với nhiều cây trồng khác, cây lạc có nhu cầu đặc biệt về nước bởi rễ không có lông hút và quả lạc được hình thành dưới đất. Sự biến đổi khí hậu làm cho lượng mưa hàng năm phân bố không đều giữa các vùng miền và các thời điểm trong năm. Trong khi đó, quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lạc có những giai đoạn rất mẫn cảm với độ ẩm, nếu những giai đoạn này thiếu nước sẽ làm giảm năng suất, chất lượng của lạc. Chính vì vậy, việc đánh giá để có biện pháp cải tạo giống lạc theo hướng nâng cao khả năng chịu hạn là rất cần thiết.
Các phương pháp đã và đang được nghiên cứu ứng dụng để cải tạo, phát huy tiềm năng của nhiều loại cây trồng như: lai giống, đột biến thực nghiệm, công nghệ tế bào thực vật và chuyển gen [30], [76], [131]. Hiệu quả việc ứng dụng công nghệ tế bào thực vật để nâng cao tính chống chịu bất lợi môi trường liên tục được khẳng định. Trong quá trình nuôi cấy in vitro do ảnh hưởng của môi trường, đặc biệt là chất kích thích sinh trưởng, các tế bào có thể bị biến đổi vật chất di truyền. Larkin và Scowcroft (1981) gọi những biến dị đó là “biến dị soma” hay “biến dị sinh dưỡng”. Nếu kết hợp nuôi cấy mô tế bào với xử lý đột biến bằng các tác nhân vật lý hay hoá học thì tần số đột biến có thể tăng thêm [85]. Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc tạo ra nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn giống [87]. Ở Việt Nam, sự ra đời của 2 giống lúa DR1 và DR2 có khả năng chịu hạn và chịu lạnh tốt là minh chứng đầu tiên cho những khả năng đó [1]. Đến nay, nhiều dòng cây có nguồn gốc in vitro mang tính trạng mong muốn được tạo ra từ quá trình xử lý và nuôi cấy mô sẹo đã được công bố [6], [34], [39], [130].
Khả năng chịu hạn của thực vật là tính trạng do nhiều gen quy định. Do vậy, việc tìm kiếm và phân tích gen liên quan đến đặc tính chịu hạn được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Một số gen liên quan đến tính chịu hạn của cây trồng đã được phân lập và công bố như: gen LEA [32]; gen DREB [113]; gen P5CS [10]; gen NCED, AhPLD [104], [128] . Gen cystatin (CYS) của thực vật được công bố đầu tiên trên cây lúa bởi Abe và đtg (1987) [40]. Đến nay, gen CYS được phân lập ở nhiều loài thực vật bậc cao, cây một lá mầm và hai lá mầm [17], [92], [95] . Các nghiên cứu về gen cystatin bàn luận nhiều về mối liên quan của nó với khả năng chống chịu hạn, lạnh, mặn [52], [57], [96], [125] .
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn của việc chọn tạo giống lạc theo hướng nâng cao khả năng chịu hạn, chúng tôi đã tiến hành đề tài của luận án: “Tạo dòng chịu hạn và phân lập gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (Arachis hypogaea L.)”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Tạo được dòng lạc có khả năng chịu hạn cao hơn giống gốc bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Xác định được sự khác biệt trong trình tự của gen cystatin giữa dòng lạc chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo và các giống lạc có khả năng chịu hạn khác nhau.