Luận Văn Khóa luận tốt nghiệp ứng dụng kỹ thuật rt - pcr để phát hiện virus gây hội chứng rối loạn sinh sản v

MỤC LỤC

Tên mục Trang

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM TẮT . iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ix

Phần I: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3

2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 3

2.1.1 Giới thiệu . 3

2.1.2 Lịch sử bệnh 3

2.1.3 Dịch tễ học 4

2.1.4 Các con đường lây nhiễm . 5

2.1.4.1 Sự lây truyền dọc . 5

2.1.4.2 Sự lây truyền ngang . 6

2.1.5 Triệu chứng lâm sàng 7

2.1.6 Bệnh tích . 8

2.2 Các phương pháp dùng trong chẩn đóan bệnh do virus PRRS gây ra . 8

2.2.1. Phân lập virus sống . 8

2.2.2. Phân lập virus hoặc kháng nguyên virus . 9

2.2.3. Phương pháp phát hiện kháng thể trong huyết thanh 10

2.2.4. Phương pháp RT- PCR để phát hiện virus gây bệnh PRRS . 12

2.3. Phương pháp PCR 13

2.3.1. Nguyên tắc 13

2.3.2. Các thành phần tham gia phản ứng PCR 13

2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR 14

2.3.4. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR 15
iv

2.4 Phương pháp RT-PCR . 16

2.4.1. Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR . 16

2.4.2. Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngược 16

2.4.3. Các primer trong phiên mã ngược 18

PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHưƠNG PHÁP . 20

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

3.2. Nội dung nghiên cứu 20

3.3. Vật liệu và hóa chất 20

3.3.1. Mẫu xét nghiệm 20

3.3.2. Cặp primer trong phản ứng RT-PCR 20

3.3.3. Vật liệu và hóa chất cho chiết tách RNA 21

3.3.4. Vật liệu và hóa chất cho điện di RNA 21

3.3.5. Vật liệu và hóa chất cho RT-PCR . 21

3.3.6. Vật liệu và hóa chất cho điện di sản phẩm RT-PCR . 22

3.4. Thiết bị và dụng cụ . 22

3.5. Các phương pháp . 22

3.5.1. Bảo quản dịch nuôi cấy tế bào 22

3.5.2. Chẩn bị và bảo quản mẫu huyết thanh 23

3.5.3. Tách chiết RNA từ dịch nuôi cấy tế bào và huyết thanh theo quy trình

sử dụng TRIzol . 23

3.5.4. Phương pháp điện di RNA trên gel biến tính 24

3.5.5. Phương pháp RT-PCR trên RNA virus . 25

3.5.6. Điện di sản phẩm RT-PCR 27

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 28

4.1. Kết quả RT-PCR trên mẫu chuẩn của PRRSV 28

4.1.1. RT-PCR với Taq beat hot start (Promega) 28

4.1.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene 29

4.2. Kết quả RT-PCR trên mẫu RNA ly trích . 30

4.2.1. RT-PCR với Taq beat hot start trên RNA ly trích từ huyết thanh bằng

phương pháp sử dụng TRIzol 30

4.2.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene trên các mẫu ly trích

từ dịch nuôi cấy tế bào sử dụng quy trình ly trích theo bộ kit 31
v

4.3. Điện di RNA trên mẫu ly trích 32

4.4. Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp primer 33

4.5. RT-PCR sử dụng cặp primer P1, P2 33

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 35

5.1. Kết luận 35

5.2. Đề nghị . 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC x
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN