Thạc Sĩ Khảo sát xử lý 1-Naphthol bằng Humin và Bacillus subtilis

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
CHUYÊN NGÀNH: HÓA VÔ CƠ
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
– 2012

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC HÌNH . ii
DANH MỤC BẢNG iv
MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .4
1.1 THAN BÙN VÀ HUMIN 4
1.1.1 Than bùn 4
1.1.2 Humin 6
1.1.3 Một số phương pháp xử lý humin thô .8
1.1.3.1 Phương pháp base (phương pháp kiềm chảy) 8
1.1.3.2 Phương pháp acid .8
1.1.3.3 Ứng dụng của humin 9
1.2 XỬ LÝ NƯỚC THẢI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC .10
1.2.1 Giới thiệu .10
1.2.2 Quá trình sinh hoá trong xử lý nước thải .10
1.2.3 Sự sinh trưởng của vi sinh vật .11
1.2.4 Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật 12
1.2.4.1 Kỹ thuật cố định tế bào trên chất mang rắn 13
1.2.4.2 Kỹ thuật nhốt tế bào trong cấu trúc gel 14
1.2.4.3 Kỹ thuật kết bông tế bào .15
1.2.4.4 Yêu cầu đối với chất cố định 15
1.2.5 Giới thiệu về Bacillus subtilis .15
1.2.5.1 Đặc điểm hình thái .16
1.2.5.2 Đặc tính sinh trưởng .16
1.2.5.3 Ứng dụng của Bacillus subtilis .17

1.5.1.2 Hệ thống thiết bị HPLC 24
1.5.1.3 Ứng dụng của phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao .24
1.5.2 Phương pháp phân tích quang phổ hấp thu UV-VIS (phổ kích thích electron) .26
1.5.2.1 Nguyên tắc 26
1.5.2.2 Máy đo phổ hấp thu UV-VIS và nguyên lý hoạt động 26

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM .28

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 28
2.1.1 Giống vi sinh vật .28
2.1.2 Nguyên liệu .28
2.1.3 Hoá chất .28
2.1.4 Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh .28
2.1.4.1 Môi trường nhân giống (MT1) [1] .28
2.1.4.2 Môi trường xử lý (MT2) [1] .29
2.1.4.3 Môi trường cấy chuyền và trải đĩa .29
2.2 NỘI DUNG THỰC NGHIỆM .30
2.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập humin và khảo sát mẫu humin 31
2.2.1.1 Phân lập humin .31

2.2.3.3 Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sắc ký đồ HPLC của 1-naphthol 33
2.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát quá trình tăng sinh khối theo thời gian của chủng Bacillus subtilis .34
2.2.4.1 Cấy giống và bảo quản giống .34
2.2.4.2 Giai đoạn nhân giống .34
2.2.4.3 Khảo sát quá trình tăng sinh khối theo thời gian của chủng Bacillus subtilis 34
2.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng xử lý 1-naphthol của các phương pháp khác nhau 35
2.2.5.1 Tạo chế phẩm vi sinh cố định trên humin 35
2.2.5.2 So sánh khả năng xử lý 1-naphthol bằng vi sinh cố định trên humin với các phương pháp khác .36
2.2.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng xử lý
1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin .37
2.2.6.1 Thí nghiệm 6a: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng humin sử dụng trong giai đoạn tạo chế phẩm vi sinh cố định đến khả năng xử lý 1-naphthol .37
2.2.6.2 Thí nghiệm 6b: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng xử lý 1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin 38

2.2.9 Thí nghiệm 9: Khảo sát khả năng tái sử dụng humin để tạo chế phẩm cố định ới .40
2.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 41
2.3.1 Xác định mật độ tế bào 41
2.3.2 Phân tích định lượng 1-naphthol .41
2.3.3 Tính toán hiệu suất xử lý 1-naphthol .41

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .42

3.1 PHÂN LẬP HUMIN VÀ KHẢO SÁT MẪU HUMIN .42
3.1.1 Phân lập humin 42
3.1.2 Phổ IR của humin 42
3.1.3 Cấu trúc bề mặt của humin 43
3.2 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 2: PHỔ UV-VIS CỦA 1-NAPHTHOL .43
3.3 KHẢO SÁT SẮC KÝ ĐỒ HPLC CỦA 1-NAPHTHOL VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG 44
3.3.1 Kết quả thí nghiệm 3a: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 1-naphthol và đường chuẩn của dung dịch 1-naphthol 44
3.3.2 Kết quả thí nghiệm 3b: Khảo sát ảnh hưởng của các loại nước lọc lên sắc ký đồ của 1-naphthol 46
3.3.3 Kết quả thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sắc ký đồ của dung dịch 1-naphthol 48
3.4 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 4: KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TĂNG SINH KHỐI THEO THỜI GIAN CỦA CHỦNG BACILLUS SUBTILIS 49

3.6.2 Kết quả thí nghiệm 6b: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng xử lý 1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin .57
3.6.3 Kết quả thí nghiệm 6c: Ảnh hưởng của nồng độ 1-naphthol ban đầu đến khả năng xử lý của chế phẩm vi sinh cố định trên humin
3.7 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 7: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THÍCH NGHI
CỦA CHẾ PHẨM VI SINH CỐ ĐỊNH TRÊN HUMIN ĐỐI VỚI 1-NAPHTHOL .64
3.8 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 8: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÁI SỬ DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH CỐ ĐỊNH TRÊN HUMIN 66
3.9 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 9: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÁI SỬ DỤNG HUMIN ĐỂ TẠO CHẾ PHẨM CỐ ĐỊNH MỚI .68

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .70

4.1 KẾT LUẬN 70
4.2 KIẾN NGHỊ 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO 73
PHỤ LỤC .77



DANH MỤC HÌNH


Hình 1.1. Sơ đồ tách các hợp chất humic từ than bùn. .5
Hình 1.2. Cấu trúc của acid fulvic .5
Hình 1.3. Cấu trúc của acid humic 5
Hình 1.4. Kết quả chụp phổ XRD của humin. 6
Hình 1.5. Kết quả chụp phổ IR của humin 7
Hình 1.6. Các nhóm chức trong humin. 8
Hình 1.7. Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật. 12
Hình 1.8. Các phương pháp cố định tế bào .13
Hình 1.9. Hình thái của Bacillus subtilis. .16
Hình 1.10. Đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis 17
Hình 1.11. Hệ thống thiết bị phân tích HPLC .24
Hình 1.12. Cấu tạo máy đo phổ hấp thu UV-VIS .26
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu chung. .30
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập humin 31
Hình 2.3. Sơ đồ khảo sát sắc ký đồ HPLC của 1-naphthol và các yếu tố ảnh hưởng 32
Hình 2.4. Sơ đồ khảo sát quá trình tăng sinh khối theo thời gian của Bacillus subtilis. .35
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng xử lý 1-naphthol bằng các phương pháp khác nhau. 36
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng humin trong quá trình tạo chế phẩm cố định đến khả năng xử lý 1-naphthol. 38
Hình 3.1. Kết quả phổ IR của humin. .42
Hình 3.2. Hình SEM của humin. .43
Hình 3.3. Phổ hấp thu UV-VIS của dung dịch 1-naphthol. 44
Hình 3.4. Đường chuẩn dung dịch 1-naphthol 45
Hình 3.5. Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 1-naphthol ở các nồng độ khác nhau 46

Hình 3.6abc: Ảnh hưởng của các loại nước lọc đến sắc ký đồ của 1-naphthol. .47
Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến sắc ký đồ của 1-naphthol. .49
Hình 3.8. Đường chuẩn giữa OD và mật độ tế bào vi sinh. 50
Hình 3.9. Đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis. .51
Hình 3.10. Xử lý 1-naphthol bằng các phương pháp khác nhau .53
Hình 3.11. Hiệu suất xử lý 1-naphthol bằng các phương pháp khác nhau. 53
Hình 3.12. Ảnh hưởng của hàm lượng humin đến khả năng xử lý 1-naphthol. .56
Hình 3.13. Ảnh hưởng của hàm lượng humin đến hiệu suất xử lý 1-naphthol .56
Hình 3.14. Ảnh hưởng của pH đến khả năng xử lý 1-naphthol. .59
Hình 3.15. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất xử lý 1-naphthol. .59
Hình 3.16. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch 1-naphthol ban đầu. 62
Hình 3.17. Hiệu suất xử lý 1-naphthol ở các nồng độ khác nhau. 63
Hình 3.18. Khả năng thích nghi với dung dịch 1-naphthol nồng độ cao. .65
Hình 3.19. Hiệu suất xử lý 1-naphthol nồng độ cao của chế phẩm vi sinh cố định trước và sau giai đoạn thích nghi. 65
Hình 3.20. Khả năng tái sử dụng của chế phẩm vi sinh cố định trên humin. .67
Hình 3.21. Khả năng tái sử dụng humin. 69
Hình 3.22. Hiệu suất xử lý 1-naphthol bằng chế phẩm vi sinh cố định trên humin mới và trên humin tái sử dụng. 69



DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Độ độc của 1-naphthol với các loài sinh vật .20
Bảng 3.1. Đường chuẩn của dung dịch 1-naphthol .45
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các loại nước lọc đến sắc ký đồ của 1-naphthol. 47
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của pH đến sắc ký đồ của dung dịch 1-naphthol. 49
Bảng 3.4. Mật độ tế bào và giá trị OD tương ứng của Bacillus subtilis. 50
Bảng 3.5. Giá trị đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis theo thời gian. .51
Bảng 3.6. Hàm lượng 1-naphthol còn lại trong dung dịch (tính theo diện tích peak)
sau khi xử lý bằng các phương pháp khác nhau. 52
Bảng 3.7. Hiệu suất (H%) xử lý 1-naphthol bằng các phương pháp khác nhau. 52
Bảng 3.8. Hàm lượng 1-naphthol còn lại trong dung dịch (tính theo diện tích peak)
khi sử dụng các hàm lượng humin khác nhau .55
Bảng 3.9. Hiệu suất (H%) xử lý 1-naphthol khi sử dụng các hàm lượng humin khác nhau. .55
Bng 3.10. Hàm lượng 1-naphthol còn lại trong dung dịch (tính theo diện tích peak)
khi xử lý ở các pH khác nhau 58
Bảng 3.11. Hiệu suất (H %) xử lý ở các pH khác nhau. .58
Bảng 3.12. Xử lý 1-naphthol ở các nồng độ khác nhau. .61
Bảng 3.13. Khả năng thích nghi của chế phẩm vi sinh cố định đối với dung dịch
1-naphthol nồng độ cao. 64
Bảng 3.14. Khả năng tái sử dụng chế phẩm vi sinh cố định trên humin. .67
Bảng 3.15. Khả năng tái sử dụng humin. 68





MỞ ĐẦU

Do xu thế phát triển của xã hội, các nhà máy, khu công nghiệp, vùng kinh tế ra đời, các đô thị mới được mở rộng đòi hỏi cần rất nhiều nước sạch. Trên thực tế, thế giới chỉ có khoảng 30 triệu km3 nước ngọt, nguồn dự trữ này không đổi trong khi nhu cầu sử dụng nước luôn tăng; nhu cầu nước hàng năm của thế giới hiện nay vào khoảng 3500 – 3900 tỉ km3 nước sạch, một nửa trong số đó trở thành nước thải.
1 m3 nước thải có thể làm nhiễm bẩn mạnh 10 m3 nước sạch nước [3]. Do đó nguồn nước mất dần khả năng tự làm sạch, nhanh chóng bị cạn kiệt, gây ra nạn thiếu nước.

Nước thải nếu chưa qua xử lý, thải trực tiếp ra môi trường, sẽ ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng nước nói chung và gây tác hại cho sức khỏe con người khi sử dụng. Chính vì vậy, xử lý nước thải đạt tiêu chuẩn qui định là vấn đề rất cấp thiết.
Trong những năm gần đây đã có một mối quan tâm ngày càng tăng về nước thải công nghiệp có chứa các hợp chất polyphenol, là những chất hết sức độc hại đối với môi trường và đối với sức khoẻ con người. 1-naphthol là một dạng polyphenol được sử dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệp tổng hợp chất hữu cơ, sản xuất chất màu azo, thuốc trừ giun sán, thuốc trừ sâu, trong công nghệ thuộc da và sản xuất giấy. Đặc biệt, 1-naphthol được xác định là sản phẩm chính của quá trình phân huỷ thuốc trừ sâu carbaryl trong điều kiện tự nhiên [2]. Chỉ với liều nhỏ 1-naphthol, có thể gây ảnh hưởng xấu tới gan, thận và chức năng của tuyến giáp [17], làm giảm nồng độ testoterone ở nam giới [22]. Về lâu dài, 1-naphthol có thể tích tụ ở các mô và gây ra các khối u ở đại trực tràng [16]. 1-naphthol cũng gây độc cho giun, tảo và các loài cá [5]. Do độc tính của nó, nước thải công nghiệp có chứa 1-naphthol nhất thiết phải được xử lý trước khi thải ra môi trường.
Đã có nhiều nghiên cứu về phương pháp loại bỏ 1-naphthol. Các phương pháp chính để loại bỏ 1-naphthol từ môi trường bao gồm: quá trình sử dụng bức xạ năng lượng cao, quá trình xúc tác quang trên các vật liệu bán dẫn, quá trình oxi hoá học, quá trình quang oxi hoá sử dụng ozon hoặc phản ứng Fenton, quá trình hấp phụ lên các vật liệu xốp, quá trình phân huỷ sinh học bởi vi sinh vật [1], [2], [5], [14], [20], [23], [24], [25], [29], [35]. Các phương pháp sử dụng quá trình oxi hoá hoá học tỏ ra có hiệu quả khi phân huỷ dung dịch 1-naphthol nồng độ thấp, nhưng đối với dung dịch 1-naphthol nồng độ cao, việc sử dụng các phương pháp này rất tốn kém. Các phương pháp sử dụng quá trình quang oxi hoá thường bị hạn chế về sự phân bố ánh sáng theo độ sâu của dung dịch [30]. Quá trình hấp phụ 1-naphthol lên humin đã tận dụng được nguồn bã thải than bùn của các nhà máy phân bón humic. Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này ở chỗ dung lượng hấp phụ thấp (dung lượng hấp phụ 15.15 mg/g humin đối với dung dịch 1-naphthol 100 ppm ở pH 0.91 trong 60 phút) [2].
Một phương pháp có ưu điểm vượt trội về hiệu quả kinh tế và hiệu quả loại bỏ 1-naphthol chính là sử dụng quá trình phân huỷ sinh học bằng vi sinh vật. Ví dụ, sau 74 giờ xử lý bằng Bacillus subtilis, hiệu quả loại bỏ 1-naphthol trong dung dịch có nồng độ 80 ppm đạt hơn 80% [1]. Ưu điểm của việc sử dụng quá trình phân huỷ sinh học 1-naphthol bằng vi sinh chính là phương pháp nuôi cấy vi khuẩn rất đơn giản, dễ dàng, kinh tế và bằng cách tăng khối lượng sinh khối kết hợp với tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy, có thể xử lý khối lượng lớn nước thải có chứa 1-naphthol cũng như các hợp chất hữu cơ khác. Nhược điểm của phương pháp là việc sử dụng vi sinh tự do dễ bị rửa trôi khỏi các hệ thống xử lý nước thải [4], [26].
Để tận dụng các ưu điểm vượt trội của phương pháp phân huỷ sinh học và khắc phục nhược điểm dễ bị rửa trôi của phương pháp, chúng tôi đã tiến hành xử lý 1-naphthol bằng vi sinh vật cố định. Ưu điểm của việc sử dụng vi sinh cố định chính là có thể xử lý tập trung, tránh được hiện tượng bị rửa trôi khỏi hệ thống xử lý, có khả năng tái sử dụng, do đó mang lại hiệu quả kinh tế và hiệu quả xử lý tốt
[33].

Khi lựa chọn giá thể cố định cho vi sinh vật, với mong muốn tận dụng nguồn bã thải than bùn của các nhà máy phân bón humic (hiện nguồn bã thải này cũng đang là yếu tố gây ô nhiễm môi trường), cũng như dựa trên các yêu cầu đối với vật liệu cố định (rẻ tiền, bền vững về mặt cơ lý hoá, bền vững dưới sự tấn công của vi khuẩn, có cấu trúc lỗ xốp hoặc bề mặt hấp phụ lớn ) [27], chúng tôi lựa chọn humin làm vật liệu cố định vi sinh trong quá trình xử lý 1-naphthol.
Xuất phát từ các vấn đề trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Khảo sát vai trò của humin trong xử lý 1-naphthol bằng vi sinh” nhằm tìm khả năng kết hợp humin và vi sinh vật để xử lý 1-naphthol với những nội dung nghiên cứu như sau:
1) Phân lập humin từ bã thải than bùn của nhà máy phân bón Humix (Bình Dương).
2) Theo dõi sự gia tăng sinh khối theo thời gian của chủng Bacillus subtilis.
3) Cố định Bacillus subtilis lên giá thể humin.
4) Khảo sát phổ hấp thu UV-VIS của 1-naphthol.
5) Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sắc ký đồ HPLC của dung dịch 1-naphthol (pH của môi trường và các loại nước lọc dùng để pha loãng dung dịch 1-naphthol).
6) So sánh khả năng xử lý 1-naphthol bằng Bacillus subtilis cố định trên humin, Bacillus subtilis tự do, humin tự do; nhằm đánh giá tiềm năng xử lý 1-naphthol bằng vi sinh cố định trên humin.
7) Tối ưu hoá các điều kiện xử lý 1-naphthol bằng vi sinh cố định trên humin.
8) Khảo sát khả năng thích nghi của vi sinh cố định trên humin đối với dung dịch 1-naphthol nồng độ cao.
9) Khảo sát số lần tái sử dụng chế phẩm vi sinh cố định trên humin.
10) Khảo sát khả năng tái sử dụng humin để tạo chế phẩm cố định mới.