Thạc Sĩ Khảo sát tình hình mang vi khuẩn Non-Typhi Salmonella không triệu chứng tại thành phố Hồ Chí Minh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh - 2011

MỤC LỤC ( Luận văn dài 96 trang có file WORD)

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU . v
DANH MỤC CÁC BẢNG vii
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ix
LỜI MỞ ĐẦU . 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1. Danh pháp và phân loại Salmonella enterica 3
1.2. Đặc điểm cấu trúc, sinh lý sinh hóa và di truyền của Salmonella enterica .4
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc 4
1.2.2. Đặc điểm sinh lý sinh hóa .7
1.2.3. Đặc điểm di truyền 7
1.3. Bệnh học nhiễm trùng do NTS 8
1.3.1. Triệu chứng lâm sàng 9
1.3.2. Sự phát sinh bệnh 9
1.3.3. Chẩn đoán 10
1.3.4. Điều trị .11
1.3.5. Phòng ngừa 12
1.4. Tình hình nhiễm NTS trên thế giới và ở Việt Nam .13
1.4.1. Tình hình nhiễm NTS trên thế giới .13
1.4.2. Tình hình nhiễm NTS ở Việt Nam 17
1.5. Các phương pháp phân loại di truyền Salmonella enterica .17
1.5.1. Phage typing 17
1.5.2. Plasmid typing .18
1.5.3. Ribotyping .18
1.5.4. PFGE .18
1.5.5. MLEE 19
1.5.6. MLST 19
1.6. Tình trạng mang vi khuẩn không triệu chứng ở S. Typhi và NTS .22
1.6.1. Tình trạng mang trùng không triệu chứng của Typhi và Paratyphi A 23
1.6.2 Tình trạng mang trùng NTS 23
1.7. Các yếu tố nguy cơ trong nhiễm trùng do NTS .24
1.7.1. Các yếu tố nguy cơ từ môi trường 24
1.7.2. Các yếu tố nguy cơ từ bản thân vật chủ 25

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28
2.2 Qui trình thực nghiệm 29
2.3 Hóa chất- thiết bị- phương pháp tiến hành 29
2.3.1 Phân lập và định danh Salmonella spp bằng API 20E .29
2.3.2 Định danh dựa trên phản ứng ngưng kết kháng nguyên kháng thể 32
2.3.3 Xác định kháng sinh đồ .33
2.3.4 Xác định sự đa dạng di truyền bằng phương pháp MLST 35
2.3.4.1 Tách chiết DNA vi khuẩn 35
2.3.3.2 PCR 7 gen giữ nhà (house keeping genes) 37
2.3.3.3 Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 38
2.3.3.4 Tinh sạch sản phẩm PCR .40
2.3.3.5 Giải trình tự các gen giữ nhà .42
2.3.3.6 Phân tích kết quả giải trình tự 44
2.3.3.7 Phân tích kết quả MLST 45
2.3.5 Xác định các yếu tố nguy cơ trong nhiễm trùng dạ dày ruột do Salmonella 46
2.3.5.1 Bảng câu hỏi khảo sát 46
2.3.5.2 Phân tích thống kê bằng phần mềm Stata 47

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN

3.1 Tỉ lệ nhiễm trùng không triệu chứng ở trẻ em dưới 5 tuổi tại thành phố Hồ Chí
Minh 49
3.2 Kết quả kháng sinh đồ của các chủng Salmonella spp phân lập từ nhóm người bệnh và nhóm người khỏe mạnh không triệu chứng 49
3.3 Kết quả phân loại di truyền bằng phương pháp MLST. 51
3.3.1 Kết quả khuếch đại các phân đoạn gen bên trong 7 gen giữ nhà 51
3.3.2 Kết quả kiểu di truyền và týp huyết thanh của những mẫu phân lập từ nhóm bệnh và nhóm mang trùng không triệu chứng 52
3.3.3 Đặc điểm các gen giữ nhà. 55
3.3.4 Kết quả cây phát sinh loài .56
3.3.5 Mối quan hệ giữa các mẫu NTS phân lập được từ nhóm bệnh và nhóm mang trùng không triệu chứng 58
3.4 Phân tích đặc điểm lâm sàng – yếu tố nguy cơ: .61
3.4.1 Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột do NTS trên trẻ em dưới 5 tuổi ở thành phố Hồ Chí Minh 61
3.4.2 Phác đồ điều trị 63
3.4.3 Sự phân bố các ca nhiễm NTS trong năm .63
3.4.4 Đặc điểm kinh tế xã hội cơ bản .64
3.4.5 Các yếu tố nguy cơ trong nhiễm trùng do NTS 65

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ
4.1 Kết luận
4.2 Đề nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC



DANH MỤC CÁC BẢNG


Bảng 2.1 Tiêu chuẩn về tính kháng đối với một số kháng sinh
của họ vi khuẩn Enterobacteriaceae . 34
Bảng 2.2 Trình tự các mồi sử dụng cho phản ứng PCR . 37
Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR . 38
Bảng 2.4 Chương trình phản ứng khuếch đại . 38
Bảng 2.5 Trình tự mồi cho phản ứng giải trình tự 42
Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự . 43
Bảng 2.7 Chương trình phản ứng giải trình tự . 44
Bảng 3.1 Kiểu di truyền của 174 chủng Salmonella spp 52
Bảng 3.2 Sự phân bố các týp huyết thanh trong nhóm bệnh và nhóm mang trùng
không triệu chứng . 53
Bảng 3.3 Nhóm huyết thanh và týp huyết thanh nổi trội ở nhóm bệnh và
nhóm mang trùng không triệu chứng 55
Bảng 3.4 Đặc điểm các gen giữ nhà . 56
Bảng 3.5 Đặc điểm lâm sàng bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột do NTS 62
Bảng 3.6 Phác đồ điều trị cho các ca nhiễm NTS 63
Bảng 3.7 Đặc điểm cơ bản của nhóm bệnh và nhóm chứng 65
Bảng 3.8 Các yếu tố nguy cơ từ môi trường 66
Bảng 3.9 Mối tương quan giữa các yếu tố nguy cơ chính trong nhiễm NTS 67



DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ


Sơ đồ 2.1 Quy trình thực hiện nghiên cứu . 29
Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ kháng kháng sinh của 174 chủng NTS . 50
Biểu đồ 3.2 Mối liên hệ giữa số ca nhiễm và nhiệt độ trung bình theo tháng 64



DANH MỤC CÁC HÌNH


Hình 1.1 Hệ thống phân loại của giống Salmonella 4
Hình 1.2 Cấu trúc tế bào vi khuẩn Salmonella spp và vách tế bào . 5
Hình 1.3 Tỉ lệ các týp huyết thanh phổ biến nhất ở người phân lập từ các
châu lục khác nhau . 15
Hình 1.4 Tỉ lệ các týp huyết thanh phổ biến nhất ở các nguồn không từ người
phân lập ở các châu lục khác nhau . 15
Hình 1.5 Kết quả cây phân loại di truyền cho Salmonella enterica 22
Hình 2.1 Kết quả que thử API 20E cho Salmonella spp . 30
Hình 2.2 Thang 100bp của Invitrogen . 39
Hình 3.1 Kết quả điện di của 7 phân đoạn gen của 7 gen giữ nhà 51
Hình 3.2 Cây phát sinh loài của 174 chủng Salmonella spp . 57
Hình 3.3 Cây Minimum spanning tree được vẽ từ dữ liệu MLST
của 174 mẫu Salmonella spp . 59


LỜI MỞ ĐẦU


Với 1.8 triệu ca tử vong mỗi năm do tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi, chiếm 19% số ca tử vong trên trẻ em, bệnh tiêu chảy cấp vẫn là nguyên nhân gây bệnh hàng đầu ở các nước đang phát triển. Trong đó thì Salmonella là một trong những tác nhân vi khuẩn chính gây bệnh với tổn thất kinh tế được tính bằng số ngày nằm viện và chi phí chữa trị. Bệnh cảnh phổ biến do Salmonella spp gây ra là tiêu chảy, tuy nhiên bệnh cũng có thể gây biến chứng nặng trên người có hệ miễn dịch yếu như trẻ em, người lớn tuổi, người nhiễm HIV . Non-typhi Salmonella (NTS) có phổ vật chủ khá rộng bao gồm người, động vật, bò sát cũng như có thể tồn tại lâu ở môi trường bên ngoài. Con đường lan truyền phổ biến nhất là thông qua việc ăn uống các thực phẩm nhiễm khuẩn.

Ở Việt Nam hiện nay có rất ít các nghiên cứu về NTS, đa số các nghiên cứu đều dừng lại ở việc xác định mức độ phổ biến của Salmonella spp phân lập được trên thực phẩm tươi sống như gia cầm, lợn, bò, tôm, cá, hải sản ở Hà Nội, Huế và Đồng Bằng Sông Cửu Long. Chỉ có một số rất ít các nghiên cứu về tác nhân NTS gây bệnh trên người ở Hà Nội với tỉ lệ NTS phân lập được vào khoảng 7% tổng số ca bệnh tiêu chảy trên trẻ em dưới 5 tuổi. Riêng ở miền Nam, hầu như không có nghiên cứu nào về NTS trên người.

Tình hình mang trùng không triệu chứng được mô tả đầu tiên ở S. Typhi và người mang trùng có thể truyền bệnh cho người khác trong cộng đồng. Cơ chế mang trùng của S. Typhi hiện đang được nghiên cứu với các yếu tố nguy cơ bao gồm bị sỏi mật, nhiễm sán máng Riêng đối với NTS hiện chưa có nghiên cứu nào về tình hình mang trùng không triệu chứng cũng như cơ chế mang trùng. Giả thuyết của chúng tôi là trẻ em mang trùng không triệu chứng cũng góp phần quan trọng trong việc lan truyền bệnh. Ngoài ra chúng tôi cũng mong muốn tìm hiểu các yếu tố nguy cơ trong nhiễm trùng dạ dày ruột do NTS. Việc xác định các yếu tố nguy cơ chính sẽ được ứng dụng trong việc ngăn ngừa bệnh nhiễm trùng do NTS trong tương lai.

Mục tiêu đề tài
- Khảo sát tỉ lệ mang trùng không triệu chứng ở trẻ em dưới 5 tuổi ở Thành phố
Hồ Chí Minh.
- Xem xét mối tương quan về mặt di truyền giữa những chủng NTS phân lập được từ nhóm bệnh và nhóm mang trùng không triệu chứng bằng cách sử dụng phương pháp phân loại di truyền MLST.
- Phân tích một số đặc điểm lâm sàng của bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột do NTS.
- Xác định các yếu tố nguy cơ chính trong bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột do NTS bằng cách phân tích thống kê các dữ liệu dịch tễ thu thập được trên nhóm bệnh và nhóm chứng.