Thạc Sĩ Khảo sát tính đa dạng di truyền và phân tích hàm lượng dầu của một số dòng Cọc rào ( Jatropha curcas

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC
2010


MỤC LỤC
Lời cảm ơn i
Mục lục ii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt . v
Danh mục các bảng . vi
Danh mục các hình vẽ, đồ thị vii
MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
1.1 Giới thiệu về cây Cọc rào . 4
1.1.1 Vị trí phân loại 4
1.1.2 Nguồn gốc 4
1.1.3 Đặc điểm sinh học 5
1.1.3.1 Hình thái và đặc tính thực vật . 5
1.1.3.2 Điều kiện sinh thái 8
1.1.4 Thành phần hóa học của cây Cọc rào . 8
1.1.4.1 Thành phần hóa học 8
1.1.4.2 Thành phần độc tố 10
1.1.5 Công dụng tổng hợp của cây Cọc rào . 13
1.1.5.1 Nhựa mủ . 13
1.1.5.2 Lá, vỏ và rễ cây . 14
1.1.5.3 Hạt và dầu . 14
1.1.6 Cọc rào và nhiên liệu sinh học 14
1.2. Sự đa dạng di truyền . 17
1.2.1 Biến dị di truyền và cấu trúc di truyền . 18
1.2.2 Dòng chảy của gen 19
1.2.3 Ý nghĩa của sự đa dạng di truyền . 19
1.3 Những phương pháp nghiên cứu đa dạng sinh học ở thực vật . 20
1.3.1 Marker di truyền . 20
1.3.2 DNA marker . 21
1.3.3 RAPD – Random amplified polymorphic DNA 21
1.3.4 Ứng dụng nghiên cứu tính đa hình DNA trong xây dựng cây phát sinh
loài 22
1.3.4.1 Một số thuât ngữ . 22
1.3.4.2 Các phương pháp chủ yếu xây dựng cây phát sinh loài . 23
1.4 Ứng dụng kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu di truyền của Cọc rào . 24
1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới . 24
1.4.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam . 24

Chương 2: Vật liệu và phương pháp 26

2.1. Vật liệu, trang thiết bị và hóa chất . 26
2.1.1 Vật liệu nghiên cứu . 26
2.1.1.1 Hạt Cọc rào . 26
2.1.1.2 Lá Cọc rào . 27
2.1.2 Dụng cụ và thiết bị cơ bản dùng trong nghiên cứu . 27
2.1.2.1 Dụng cụ . 27
2.1.2.2 Thiết bị 27
2.1.3 Hóa chất 28
2.1.3.1 Hóa chất tách chiết DNA . 28
2.1.3.2 Hóa chất điện di . 29
2.1.3.3 Hóa chất phản ứng PCR . 29
2.1.3.4 Thang DNA 30
2.2 Phương pháp nghiên cứu 30
2. 2.1 Các phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA . 30
2.2.2 Các chỉ tiêu đánh giá sản phẩm DNA thu được sau khi tách chiết 32
2.2.3 Thiết lập phản ứng RAPD 33
2.2.3.1 Chương trình phản ứng RAPD 33
2.2.3.2 Thành phần phản ứng RAPD . 33
2.2.3.3 Tối ưu hóa thành phần phản ứng RAPD . 33
2.2.4 Phân tích kết quả đa hình từ phản ứng RAPD 34
2.2.4.1 Phân tích kết quả đa hình của các cá thể Cọc rào 34
2.2.4.2 . Phân tích khoảng cách di truyền giữa ba quần thể Cọc rào: Bình Thuận, Ninh Thuận và Thành phố Hồ Chí Minh 35
2.2.5 Phương pháp phân tích hàm lượng dầu và thành phần acid béo của
hạt Cọc rào . 35
2.2.5.1 Phương pháp AOCS Aa 4-38 . 35
2.2.5.2 Phương pháp AOCS Ce 1e-91 . 36

Chương 3 : Kết quả và biện luận 38
3.1. Kết quả khảo sát quá trình tách chiết DNA . 38
3.2 . Tối ưu hóa phản ứng RAPD . 40
3.2.1 Khảo sát nồng độ Dntp 41
3.2.2 Khảo sát nồng độ DNA lam mạch khuôn 41
3.2.3 Khảo sát nồng độ mồi 42
3.2.4 Khảo sát nồng độ Mg2+ . 43
3.2.5 Khảo sát nồng độ Tag polymerase . 44
3.3. Đa dạng di truyền của cây Cọc rào qua khảo sát bằng kỹ thuật RAPD . 46
3.3.1 Kết quả đa hình thu được sau phản ứng RAPD-PCR . 46
3.3.1.1 Sàng lọc mồi . 46
3.3.1.2 Kết quả khuếch đại DNA 46

3.3.2 Tương quan di truyền giữa các mẫu khảo sát dựa trên hệ số tương ứng
đơn giản (SM coefficient) . 52
3.3.3 Phân nhóm di truyền các mẫu Cọc rào khảo sát 53
3.3.4 Khảo sát tính đa dạng và cấu trúc di truyền của 3 dòng Cọc rào
Bình Thuận, Ninh Thuận và Thành phố Hồ Chí Minh . 58
3.3.4.1 Tính đa dạng và cấu trúc di truyền của 3 quần thể Cọc rào . 62
3.3.4.2 Tương quan di truyền giữa 3 quần thể Cọc rào khảo sát dựa trên
khoảng cách di truyền 64
3.4 Phân tích hàm lượng dầu và thành phần acid béo của dầu hạt Cọc rào 65
3.4.1. Phân tích hàm lượng của dầu hạt Cọc rào . 65
3.4.2 Phân tích thành phần acid béo của dầu hạt Cọc rào . 66
3.4.3. So sánh hàm lượng dầu và 4 acid béo chính giữa mẫu AĐ và AĐ/F1 . 71

Chương 4: Kết luận và đề nghị . 73
4.1 Kết luận . 73
4.2 Đề nghị . 75
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC



MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển kinh tế toàn cầu, nhu cầu năng lượng và nhiên liệu ngày càng tăng nhất là nhiên liệu dùng cho giao thông. Trong khi đó nguồn năng lượng chính là dầu mỏ đang dần dần cạn kiệt. Theo dự báo của các nhà khoa học, đến khoảng năm 2050-2060, nếu không tìm được những nguồn năng lượng mới thay thế, thế giới có thể lâm vào cảnh khủng hoảng năng lượng nghiêm trọng [3].

Việc tiêu thụ một khối lượng khổng lồ dầu mỏ như trong giai đoạn hiện nay đã, đang và sẽ gây nên hậu quả khủng khiếp về môi trường, sức khoẻ. Hiệu ứng nhà kính do lượng khí cacbonnic thải ra từ việc đốt cháy dầu mỏ đã làm cho trái đất nóng dần lên [82]. Quá tải cơ chế điều hòa khí hậu khiến nước biển dâng lên, bão tố, hạn hán, lũ lụt cũng tăng về tần suất và cường độ. Khí thải từ dầu khí là một trong các nhân tố quan trọng làm tăng tỷ lệ ung bướu, bệnh tim mạch, bệnh hô hấp Do vậy, nhiều quốc gia trên thế giới đã có chính sách kết hợp việc sử dụng tiết kiệm và hiệu quả các dạng năng lượng hiện có với chính sách sử dụng dạng năng lượng mới thân thiện môi trường [82].
Có nhiều nguồn năng lượng đã được đề xuất như khai thác năng lượng mặt trời, năng lượng gió, thủy triều, sử dụng nguyên liệu hydro Và khoảng 30 năm trở lại đây, một hướng rất mới là sử dụng dầu diesel sinh học (biodiesel) nhằm thay thế một phần nguồn nhiên liệu hóa thạch. Biodiesel được chiết xuất hoàn toàn từ thực vật như hạt cải dầu (Mỹ), hạt hướng dương (Ý và Miền nam nước Pháp), đậu nành (Mỹ và Braxil), hạt cây bông (Hy Lạp), dầu cọ (Malaysia) và từ hạt cây Cọc Rào (Nicaragoa và Nam Mỹ) [10]. Cây Cọc rào du nhập vào Việt Nam từ rất lâu, được sử dụng làm thuốc chữa bệnh, trồng làm hàng rào và hạt được sử dụng để thắp sáng [3] So với các cây khác, cây Cọc rào có ưu điểm vượt trội hơn hẳn các loài cây cho dầu khác về khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường. Ngoài sử dụng hạt để lấy dầu, việc trồng cây này còn giúp cải tạo đất và môi trường nhất là ở những vùng đất hoang, khô cằn, nghèo dinh dưỡng [10]. Cây Cọc rào mang lại lợi ích kinh tế gắn chặt với đời sống và thu nhập cộng đồng nông thôn, có thể giúp người nông dân xóa đói giảm nghèo ngay trên những vùng đất bỏ hoang mà nhiều cây trồng khác không phát triển được [6].
Qua điều tra thực tế ở Việt Nam cho thấy, cây Cọc rào mọc hoang dại trong tự nhiên ở độ cao tới trên 1000 m trên mặt biển, chúng có mặt ở hầu hết các tỉnh. Có giống có hàm lượng dầu đạt 40% như ở huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng. Sự phong phú về mặt phân bố này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với công tác bảo tồn nguồn gen cây Cọc rào cũng như việc tuyển chọn và tạo giống [3].
Hiện nay có rất nhiều công ty trong nước và ngoài nước đang đầu tư trồng và khai thác hạt cây này ở nhiều tỉnh thành của nước ta. Nhưng theo nhiều nghiên cứu cho thấy cây Cọc rào ở nước ta vẫn là một cây hoang dại, nửa hoang dại, mới chuyển thành cây trồng trong thời gian ngắn. Tài liệu nghiên cứu về cây này còn quá sơ sài, nhất là về khía cạnh kinh tế [4]. Nước ta chưa có giống tuyển chọn năng suất cao được công nhận phổ biến cho sản xuất. Cây Cọc rào được trồng đại trà ở nhiều vùng với nguồn giống nhập từ nước ngoài và thu thập từ các địa phương trong nước chưa qua khảo nghiệm, thiếu kiểm nghiệm [4]. Phương pháp nhân giống chủ yếu vẫn theo lối cổ truyền là bằng cách gieo hạt và giâm cành, do đó tính đa dạng di truyền của các dòng Cọc rào và hàm lượng dầu cũng như thành phần acid béo của dầu hạt Cọc rào là điều rất đáng quan tâm đối với lĩnh vực bảo tồn và khai thác nguồn tài nguyên này.

Mức đa dạng di truyền của quần thể càng cao thì quần thể càng có khả năng sống sót trước những biến đổi của điều kiện môi trường. Tính đa dạng di truyền của quần thể còn giúp các nhà chọn giống có nhiều lựa chọn hơn trong việc chọn ra nguồn giống có năng suất và hàm lượng dầu cao phục vụ cho công tác nghiên cứu và cho sản xuất. Ngoài ra, việc sử dụng marker phân tử để đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể Cọc rào còn giúp nhà chọn giống xác định được giống của từng địa phương cũng như giống nhập từ nước ngoài.
Dựa vào những kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền và hàm lượng dầu cũng như thành phần acid béo của dầu hạt Cọc rào, chúng tôi bước đầu chọn kĩ thuật RAPD - PCR để khảo sát tính đa dạng di truyền giữa các cá thể Cọc rào và khảo sát mức đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền của các dòng Cọc rào thu thập được, phương pháp AOCS Aa 4 – 38 để phân tích hàm lượng dầu và phương pháp AOCS Ce 1e-91 để phân tích thành phần acid béo trong dầu hạt Cọc rào thông qua đề tài “KHẢO SÁT TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG DẦU CỦA MỘT SỐ DÒNG CỌC RÀO ( Jatropha curcas L.)”.

Mục tiêu của đề tài:

1. Khảo sát mối quan hệ di truyền giữa một số cá thể Cọc rào thu thập ở các tỉnh: Ninh Thuận, Bình Thuận, Phú Yên, Khánh Hòa, Lâm Đồng, Tp. Hồ Chí Minh và hai giống nhập ngoại từ Ấn Độ và Thái Lan bằng kỹ thuật RAPD:
● Khảo sát mức độ tương quan di truyền giữa các cá thể Cọc rào.
● Khảo sát mức đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền của ba dòng
Cọc rào ở tỉnh Bình Thuận, Ninh Thuận và Thành phố Hồ Chí Minh.
2. Phân tích hàm lượng dầu và thành phần acid béo của dầu hạt Cọc rào thu thập được.