Thạc Sĩ Khảo sát thành phần và tỷ lệ loài ký sinh trùng sốt rét tại huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước bằng kỹ t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2012

MỤC LỤC ( Luận văn dài 124 trang có File WORD)

Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Bệnh sốt rét 5
1.1.1. Định nghĩa 5
1.1.2. Ký sinh trùng sốt rét 5
1.1.3. Véc tơ truyền bệnh sốt rét 7
1.1.4. Vật chủ cảm thụ 8
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lây truyền bệnh sốt rét 9
1.2. Phân bố và cơ cấu KSTSR trên thế giới và Việt Nam 9
1.2.1. Phân bố và cơ cấu KSTSR trên thế giới 9
1.2.2. Phân bố và cơ cấu KSTSR ở Việt Nam 10
1.3. Tình hình sốt rét của Việt Nam và huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước 12
1.3.1. Tình hình sốt rét của Việt Nam 12

1.6. Các biện pháp phòng chống bệnh sốt rét 25

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 27
2.1.1. Đối tượng 27
2.1.2. Thời gian 27
2.1.3. Địa điểm 27
2.2. Vật liệu nghiên cứu 27
2.2.1. Mẫu chứng dương 27
2.2.2. Vật liệu của kỹ thuật nhuộm Giêm sa 27
2.2.3. Vật liệu của kỹ thuật PCR 28
2.2.3.1. Hóa chất dùng để tách chiết DNA 28
2.2.3.2. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR 28
2.2.3.3. Hóa chất dùng cho điện di 29
2.3. Các thiết bị chính 30
2.4. Phương pháp nghiên cứu 30
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu 30
2.4.2. Phương pháp thu thập số liệu 30
2.4.2.1. Cỡ mẫu 30
2.4.2.2. Thu thập mẫu máu ngoại vi trên lam kính 31


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38
3.1. Kết quả 39
3.1.1. Kết quả xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật
nhuộm Giêm sa 39
3.1.2. Kết quả xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật
Nested - PCR 45
3.1.3. So sánh kỹ thuật nhuộm Giêm sa và kỹ thuật Nested - PCR
trong việc phát hiện KSTSR 51
3.1.4. Kết quả giải trình tự 54
3.2. Bàn luận 55
3.2.1. Thành phần, tỷ lệ loài KSTSR tại các điểm thu thập mẫu 55
3.2.2. Những trường hợp khác biệt kết quả giữa kỹ thuật Giêm sa
và kỹ thuật PCR 56
3.2.3. Phát hiện những ca nhiễm KSTSR hiếm gặp 59
3.2.4. Ký sinh trùng lạnh 60
3.2.5. Thay đổi về cơ cấu KSTSR của huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63
A. Kết luận 64
B. Kiến nghị 65
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC




DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Tình hình sốt rét cả nước giai đoạn 2006 - 2010 13
Bảng 1.2. Các vùng dịch tễ sốt rét và can thiệp năm 2009 14
Bảng 1.3. Tình hình sốt rét tại huyện Bù Đăng 2008 - 2010 15
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi đặc hiệu cho Plasmodium 28
Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho 4 loài KSTSR 28
Bảng 2.3. Kích thước sản phẩm PCR của 4 loài KSTSR 35
Bảng 3.1. Số ca KST dương tính xác định bằng Giêm sa 41
Bảng 3.2. Cơ cấu KSTSR xác định bằng Giêm sa 42
Bảng 3.3. Các trường hợp nhiễm phối hợp phát hiện bằng Giêm sa 44
Bảng 3.4. Tần suất các loài KSTSR xác định bằng Giêm sa 44
Bảng 3.5. Số ca KST dương tính xác định bằng Nested - PCR 47
Bảng 3.6.Cơ cấu KSTSR xác định bằng Nested - PCR 48
Bảng 3.7. Các trường hợp nhiễm phối hợp phát hiện bằng Nested - PCR 50
Bảng 3.8. Tần suất các loài KSTSR xác định bằng Nested - PCR 50
Bảng 3.9. So sánh kết quả của kỹ thuật Giêm sa và Nested - PCR 51
Bảng 3.10. Những trường hợp khác biệt giữa 2 kỹ thuật 51



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Chu kỳ phát triển của KSTSR (Nguồn CDC) 7
Hình 1.2. Hình thể 4 loài KSTSR nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi 17
Hình 1.3. Hình thể KSTSR P. knowlesi nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi 17
Hình 1.4. Test chẩn đoánh nhanh 19
Hình 1.5. KSTSR phát hiện bằng phương pháp QBC 20
Hình 1.6. Chu trình phản ứng PCR 21
Hình 1.7. Sơ đồ kỹ thuật Nested - PCR xác định 4 loài KSTSR 22
Hình 1.8. Hình ảnh kết quả chạy điện di các loài KSTSR 23
Hình 3.1. Lam máu nhuộm Giêm sa 39
Hình 3.2. KSTSR P. falciparum trên lam máu nhuộm Giêm sa 40
Hình 3.3. KSTSR P. vivax trên lam máu nhuộm Giêm sa 40
Hình 3.4. KSTSR P. malariae trên lam máu nhuộm Giêm sa 41
Hình 3.5. Biểu đồ số ca KSTSR dương tính xác định bằng Giêm sa 42
Hình 3.6. Biểu đồ cơ cấu KSTSR tại các điểm nghiên cứu xác định bằng Giêm sa 43
Hình 3.7. Biểu đồ cơ cấu KSTSR xác định bằng Giêm sa 43
Hình 3.8. Biểu đồ tần suất loài KSTSR xác định bằng Giêm sa 43
Hình 3.9. Hình ảnh kết quả PCR những mẫu nhiễm P. falciparum 45
Hình 3.10. Hình ảnh kết quả PCR ca nhiễm phối hợp P. falciparum, P. vivax
và P. ovale 46
Hình 3.11. Hình ảnh kết quả PCR sản phẩm nhiễm đơn P. falciparum 46
Hình 3.12. Hình ảnh kết quả nhiễm phối hợp P. falciparum, P. vivax, P. malariae
và nhiễm đơn P. vivax 47
Hình 3.13. Biểu đồ số ca KSTSR dương tính xác định bằng Nested - PCR 48
Hình 3.14. Biểu đồ cơ cấu KSTSR tại các điểm nghiên cứu xác định
bằng Nested - PCR 49
Hình 3.15. Biểu đồ cơ cấu KSTSR xác định bằng kỹ thuật Nested - PCR 49
Hình 3.16. Biểu đồ tần suất các loài KSTSR xác định bằng Nested - PCR 50



MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Sốt rét là một bệnh lây qua đường máu, do ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) truyền từ người bệnh sang người lành bởi muỗi Anopheles (hay còn gọi là muỗi đòn xóc). Sốt rét là một trong những căn bệnh gây tử vong hàng đầu thế giới. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), hiện có 106 quốc gia và vùng lãnh thổ có sốt rét lưu hành. Hàng năm, có khoảng 350 đến 500 triệu người mắc sốt rét và gần 1 triệu người tử vong do sốt rét, đa số là phụ nữ và trẻ em ở châu Phi [30].
Trước đây, được biết có 4 loài KSTSR gây bệnh cho người là Plasmodium falciparum (P. falciparum), Plasmodium vivax (P. vivax), Plasmodium malariae (P. malariae), Plasmodium ovale (P. ovale). Gần đây, một số báo cáo cho thấy Plasmodium knowlesi (P. knowlesi), một ký sinh trùng (KST) của loài khỉ, cũng có thể gây bệnh cho người.
Bệnh sốt rét thường dễ bị nhầm lẫn với các bệnh gây sốt khác như: cảm cúm, sốt Dengue, sốt mò, thương hàn Đồng thời, mỗi loài KSTSR có chu kỳ phát triển và bệnh lý khác nhau. Đặc biệt, ký sinh trùng (KST) P. falciparum nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời có thể dẫn đến sốt rét ác tính với các triệu chứng sốt rét não, đái huyết cầu tố, thiếu máu nặng, suy thận, suy gan, trụy tim mạch . gây tử vong. Do đó, chẩn đoán chính xác và kịp thời loài KSTSR gây bệnh là một khởi đầu quan trọng đối với công tác điều trị.
Xác định thành phần, cơ cấu của KSTSR tại một khu vực góp phần cung cấp số liệu cho việc hoạch định chính sách thuốc, cung cấp phác đồ điều trị cho từng vùng, xây dựng bản đồ dịch tễ sốt rét và chiến lược phòng chống phù hợp.
Phương pháp soi lam máu nhuộm Giêm sa nhận biết hình thể đặc trưng của các loài KSTSR dưới kính hiển vi là phương pháp xét nghiệm thường quy được áp dụng rộng rãi trong mọi điều kiện thực địa cũng như trong phòng thí nghiệm để chẩn đoán, phát hiện KSTSR. Phương pháp này được xem như là “chuẩn vàng” trong đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sốt rét mới.

Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, một số phương pháp mới đã được nghiên cứu, triển khai đã cung cấp những hướng nghiên cứu mới về KSTSR. Đặc biệt, phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) ngoài việc phát hiện được KSTSR ở mật độ thấp (1KST/1àl máu) còn có khả năng xác định các trường hợp nhiễm phối hợp nhiều loài KSTSR giúp chẩn đoán, điều trị bệnh kịp thời; qua đó, hạn chế tình trạng KST kháng thuốc sốt rét, cung cấp dẫn liệu về thành phần và tỷ lệ loài KSTSR ứng dụng trong việc lập bản đồ dịch tễ sốt rét.
Tại Việt Nam, trong những thập niên qua, cùng với sự phát triển và những thành tựu của ngành y tế, công tác phòng chống sốt rét (PCSR) đã đạt được những kết quả đáng kể, làm giảm số người mắc, số người chết và hạn chế bùng phát dịch sốt rét, góp phần vào sự nghiệp chăm sóc và bảo vệ sức khỏe nhân dân. Tuy nhiên, do nước ta có điều kiện thuận lợi về địa lý, khí hậu cho sự phát triển của muỗi Anopheles, trung gian truyền bệnh; cơ cấu KSTSR tại những vùng sốt rét lưu hành có sự thay đổi; đồng thời, trình độ dân trí và ý thức phòng chống bệnh một số nơi chưa cao, cộng với hiện tượng di dân tự do làm cho tình hình bệnh sốt rét vẫn còn diễn biến phức tạp.
Được sự quan tâm và đầu tư của Chính phủ, tỉnh Bình Phước nằm trong vùng kinh tế trọng điểm phía Nam bao gồm các tỉnh, thành phố: TP. Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Dương, Bình Phước, Tây Ninh, Long An và Tiền Giang. Đây cũng là một trong những địa phương có tình hình sốt rét lưu hành nặng. Tỉnh Bình Phước với dân số 894.941 người (năm 2010), toàn tỉnh có 856.477 người sống trong vùng sốt rét lưu hành (chiếm 95,7% dân số). Theo thống kê năm 2010, cả nước có 54.297 ca mắc sốt rét, riêng tỉnh Bình Phước có 3.566 ca (chiếm tỷ lệ 6,7%) [21].
Do đó, để thực hiện tốt công tác chăm sóc sức khoẻ nhân dân, việc nghiên cứu thành phần, tỷ lệ loài KSTSR của tỉnh Bình Phước để có biện pháp can thiệp đúng, hạn chế sự lây truyền và tiến đến loại trừ bệnh sốt rét là việc làm cần thiết.

Huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước là một trong hai nơi có lượng KST cao nhất tỉnh Bình Phước. Tiến hành nghiên cứu tại đây sẽ cho biết cơ cấu và thành phần KST chính xác nhất. Ngoài ra, đây là nơi đã có báo cáo hiện tượng giảm tác dụng của thuốc sốt rét artesunat, chọn địa điểm này sẽ giúp hiểu biết sâu hơn về cơ cấu, thành phần KST, giúp đề ra các biện pháp khắc phục.

2. Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát thành phần và tỷ lệ loài KSTSR tại huyện Bù Đăng, tỉnh Bình
Phước bằng kỹ thuật nhuộm Giêm sa và Nested - PCR.

3. Nội dung thực hiện
+ Xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật nhuộm Giêm sa.
+ Xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật Nested - PCR.
+ So sánh kỹ thuật nhuộm Giêm sa và kỹ thuật Nested - PCR trong việc phát hiện KSTSR.