Thạc Sĩ Khảo sát sự tăng trưởng in vitro của cây đương quy nhật bản (Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Ki

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm – hướng Sinh lý Thực vật
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NĂM 2012

MỤC LỤC

MỤC LỤC i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT . v
DANH MỤC BẢNG . vi
DANH MỤC HÌNH viii
MỞ ĐẦU . 1

1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3

1.1. Giới thiệu sơ lược về cây Angelica acutiloba Kitagawa 3
1.1.1. Phân loại 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật 4
1.1.3. Phân bố sinh thái . 4
1.1.4. Thành phần hóa học 5
1.1.5. Công dụng dược lý . 6
1.1.6. Trồng và chế biến (Fukuda và cs, 2009) . 6
1.2. Một số nghiên cứu về cây đương quy Nhật Bản Angelica acutiloba (Siebold
& Zucc.) Kitagawa . 8
1.2.1. Trong nước 8
1.2.2. Ngoài nước . 9
1.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật 10
1.3.1. Nuôi cấy lớp mỏng tế bào 10
1.3.2. Vi nhân giống truyền thống (conventional micropropagation) . 12
1.3.3. Vi nhân giống quang tự dưỡng (photoautotrophic micropropagation) 17
1.4. Những đặc điểm của một số yếu tố hóa học và vật lý in vitro và ảnh hưởng của chúng đối với sinh trưởng của cây . 25
14.1. Yếu tố hóa học . 25

1.4.2. Yếu tố vật lý . 28

2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . . 33

2.1. Vật liệu . 33
2.1.1. Vật liệu thí nghiệm 33
2.1.2. Vật liệu sinh trắc nghiệm 33
2.1.3. Các dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm . 33
2.1.4. Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 33
2.1.5. Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 34
2.1.6. Giá thể sử dụng trong thí nghiệm . 34
2.2. Phương pháp 35
2.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự tạo chồi đương quy Nhật
Bản từ các nguồn vật liệu khác nhau 35
2.2.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường, vitamin và độ thông thoáng của hộp nuôi cây lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro và tác động lên cây con ex vitro . 37
2.2.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của thành phần khoáng và giá thể lên sự tăng
trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng . 39
2.2.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản in vitro nuôi cấy quang tự dưỡng 41
2.2.5. Quan sát hình thái giải phẫu . 42
2.2.6. Hàm lượng chlorophyll a, b (mg/g lá khô) 42
2.2.7. Hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh 43
2.2.8. Hàm lượng đường tổng số, hàm lượng tinh bột . 45
2.2.9. Hiệu suất quang hợp thuần Pn (µmol mol-1 h-1/cây) . 46
2.2.10. Tốc độ tăng trưởng tương đối (Relative growth rate, RGR) (mg mg-1 ngày-
1) và hiệu suất đồng hóa thuần (Net assimilation rate, NAR) (mg cm-2 ngày-2) . 47

2.2.11. Chiều dài, chiều rộng và số lượng khí khổng . 47
2.3. Phương pháp tính toán số liệu 48
2.3.1. Tỷ lệ (%) cây sống trong giai đoạn ex vitro 48
2.3.2. Gia tăng trọng lượng tươi (GTTLT) (mg/cây) . 48
2.3.3. Gia tăng trọng lượng khô (GTTLK) (mg/cây) . 48
2.3.4. Tỷ lệ trọng lượng thân lá/rễ 48
2.3.5. Số lá (SL) (lá/cây) 48
2.3.6. Chiều cao tán (CCT) (mm/cây) . 49
2.3.7. Chiều dài rễ (CDR) (mm/cây) . 49
2.3.8. Phần trăm chất khô (% CK) . 49
2.3.9. Diện tích lá (DTL) (cm2/cây) . 49
2.4. Phân tích thống kê . 49
2.5. Nơi thực hiện đề tài nghiên cứu của luận văn 49

3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 50

3.1. Kết quả . 50
3.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự tạo chồi đương quy Nhật Bản từ các nguồn vật liệu khác nhau . 50
3.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường, vitamin và độ thông thoáng của hộp nuôi cây lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro và tác động lên cây con ex vitro . 58
3.1.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của thành phần khoáng và giá thể lên sự tăng
trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng . 67
3.1.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản in vitro nuôi cấy quang tự dưỡng 80
3.2. Thảo luận . 95

3.2.1. Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự tạo chồi đương quy Nhật Bản từ các nguồn vật liệu khác nhau . 95
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường, vitamin và độ thông thoáng của hộp nuôi cây lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro và tác động lên cây con ex vitro 98
3.2.3. Ảnh hưởng của thành phần khoáng và giá thể lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng . 102
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên sự tăng
trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản in vitro nuôi cấy quang tự dưỡng . 108

4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 115

4.1. Kết luận 115
4.2. Đề nghị . 115
TÀI LIỆU THAM KHẢO 116
Tài liệu tiếng Việt . 116
Tài liệu tiếng Anh . 117
PHỤ LỤC




DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Bảng bố trí thí nghiệm 1 36
Bảng 2.2. Bảng bố trí thí nghiệm 2 37
Bảng 2.3. Bảng bố trí thí nghiệm 3 40
Bảng 2.4. Bảng bố trí thí nghiệm 4 41
Bảng 3.1. Sự hình thành chồi đương quy Nhật Bản theo thời gian nuôi cấy . 51
Bảng 3.2. Tỷ lệ chồi hình thành theo vị trí lát cắt sau 42 ngày nuôi cấy . 53
Bảng 3.3. GTTLT, GTTLK, % CK, TLT rễ và TLK rễ của cây đương quy Nhật Bản in vitro nuôi cấy trong điều kiện QTD và QDD vào ngày nuôi cấy thứ 42 58
Bảng 3.4. CCT, CDR, SL mở và DTL của cây đương quy Nhật Bản in vitro ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau sau 42 ngày nuôi cấy . 60
Bảng 3.5. Hàm lượng chlorophyll a, b, chlorophyll a + b và tỷ lệ chlorophyll a/b của
cây đương quy Nhật Bản in vitro ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau sau 42 ngày . 60
Bảng 3.6. GTTLT, GTTLK, % CK, TLT rễ, TLK rễ và % CK rễ của cây đương quy
Nhật Bản in vitro sau 150 ngày trồng ở vườn ươm . 63
Bảng 3.7. Chiều cao tán, chiều dài rễ, số lá mở và diện tích lá của cây đương quy Nhật
Bản ex vitro sau 150 ngày ở vườn ươm 66
Bảng 3.8. GTTLT và GTTLK của cây đương quy Nhật Bản dưới tác động của các thành phần khoáng và giá thể vào ngày nuôi cấy thứ 21 và 4 67
Bảng 3.9. TLT rễ, TLK rễ, tỷ lệ cây có rễ thứ cấp và CDR của cây đương quy Nhật
Bản sau 42 ngày nuôi cấy . 70
Bảng 3.10. SL héo, SL mở và DTL của cây đương quy Nhật Bản in vitro ở ngày nuôi cấy thứ 21 và 42 76
Bảng 3.11. Hàm lượng chl a, chl b, chl a+b và tỷ lệ chl a/b của lá cây đương quy Nhật
Bản sau 42 ngày nuôi cấy . 78

Bảng 3.12. Cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng và lượng ánh sáng cung cấp/ngày
tương ứng của từng nghiệm thức trong thí nghiệm 4 80
Bảng 3.13. GTTLT, GTTLK và tốc độ tăng trưởng tương đối (RGR) của cây đương
quy Nhật Bản vào ngày nuôi cấy thứ 42 . 81
Bảng 3.14. % CK, TLK thân lá/rễ, TLK rễ và TLK lá của cây đương quy Nhật Bản sau
42 ngày nuôi cấy 85
Bảng 3.15. SL mới, SL mở, DTL mới và DTL mở của cây đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy . 86
Bảng 3.16. Tỷ lệ chl a/b, chiều dài (CD) khí khổng, Chiều rộng (CR) khí khổng và số lượng khí khổng (SLKK) của cây đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy 89
Bảng 3.17. Hiệu suất đồng hóa thuần (NAR), đường tổng và tinh bột của cây đương
quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy 92
Bảng 3.18. Hoạt tính các CĐHSTTV nội sinh trong cây đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy . 93
Bảng 3.19. Hàm lượng các ion đa lượng và tỷ lệ ion giữa các môi trường 106


DANH MỤC HÌNH



Hình 1.1. Cây đương quy Nhật Bản 3 năm tuổi . 3
Hình 1.2. Một số hợp chất hóa học chính có trong tinh dầu Cây đương quy Nhật Bản . 5
Hình 1.3. Quy trình trồng cây đương quy Nhật Bản tại miền Bắc tỉnh Sichuan, Trung
Quốc (Fukuda và cs, 2009) . 7
Hình 1.4. Các loại nắp hộp nuôi cây làm tăng khả năng trao đổi khí 19
Hình 1.5. Các giai đoạn nuôi cấy trong vi nhân giống quang dị dưỡng và quang tự dưỡng (Kozai và Kubota, 2005a) 22
Hình 2.1. Mẫu ban đầu: (a) phiến lá, (b) cuống lá, (c) chồi 35
Hình 2.2. Chồi cây đương quy Nhật Bản in vitro . 37
Hình 2.3. Sơ đồ ly trích chất điều hòa sinh trưởng thực vật 43
Hình 3.1. % mẫu tạo chồi theo thời gian 50
Hình 3.2. Cụm chồi đương quy Nhật Bản ở các nghiệm thức vào ngày nuôi cấy thứ 42
Hình 3.3. Sự phát sinh chồi từ lớp mỏng chồi đương quy Nhật Bản . 54
Hình 3.4. Sự biến đổi của phiến lá ở các nghiệm thức vào ngày thứ 42 55
Hình 3.5. Sự biến đổi hình thái của cuống lá ở các nghiệm thức vào ngày thứ 42 56
Hình 3.6. Cây đương quy Nhật Bản in vitro sau 42 ngày nuôi cấy . 59
Hình 3.7. Nồng độ CO2 bên ngoài (OUT) phòng nuôi cây và bên trong (IN) hộp nuôi cây ở hai nghiệm thức QTD và QDD theo thời gian . 61
Hình 3.8. Pn của cây đương quy Nhật Bản in vitro theo thời gian nuôi cấy 62
Hình 3.9. Cây đương quy Nhật Bản in vitro trồng tại vườn ươm ngày thứ 150 64
Hình 3.10. Cây đương quy Nhật Bản in vitro trồng tại vườn ươm ngày thứ 100 65
Hình 3.11. Bộ rễ của cây đương quy Nhật Bản sau 150 ngày trồng tại vườn ươm 65
Hình 3.12. Cây đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy trên các thành phần khoáng và giá thể khác nhau
Hình 3.13. Rễ đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy dưới ảnh hưởng của khoáng và giá thể 72
Hình 3.14. Sự hình thành rễ bất định của cây đương quy Nhật Bản ở nghiệm thức EV (khoáng Enshi, giá thể Vermiculite) . 73
Hình 3.15. Ảnh hưởng của thành phần khoáng và giá thể lên tỷ lệ trọng lượng khô thân lá/rễ của cây đương quy Nhật Bản in vitro vào ngày nuôi cấy thứ 42 . 75
Hình 3.16. Pn của cây đương quy Nhật Bản theo thời gian nuôi cấy . 79
Hình 3.17. Cây đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy dưới tác động của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng . 82
Hình 3.18. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên TLT lá và
TLT rễ của cây đương quy Nhật Bản ở ngày nuôi cấy thứ 42 . 84
Hình 3.19. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên chiều cao tán và chiều dài rễ cây đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy . 88
Hình 3.20. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên chiều dài chiều rộng và số lượng khí khổng sau 42 ngày nuôi cấy. 90
Hình 3.21. Pn của cây đương quy Nhật Bản in vitro theo thời gian nuôi cấy 91



DANH MỤC CÁC BẢNG


Bảng 1.1. Vai trò và chức năng các protein đặc trưng của virus cúm A . 3
Bảng 1.2. Các epitope virus cúm ở người được lựa chọn để kiểm tra khả năng phòng ngừa virus 8
Bảng 1.3. Danh sách các epitope đã được dự đoán bằng phương pháp Tin Sinh học bởi đề tài KC.04.18/06-10 . 15
Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của các mồi sử dụng trong luận văn . 28
Bảng 2.2. Thành phần gel điện di polyacrylamide 12,5% 42
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ plasmid pVFT-hab 53
Bảng 3.2. Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng với các nồng độ IPTG khác nhau . 61
Bảng 3.3. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2-HAeB
theo các nồng độ IPTG cảm ứng . 62
Bảng 3.4. Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng ở các nhiệt độ khác nhau 63
Bảng 3.5. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2- HAeB theo các nhiệt độ cảm ứng khác nhau . 63
Bảng 3.6. Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng ở các tốc độ lắc khác nhau 65
Bảng 3.7. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2- HAeB theo các tốc độ lắc khác nhau 65
Bảng 3.8. Kết quả phân tích hàm lượng và độ sạch mẫu protein tinh chế bằng đo hấp
thu quang phổ 68


MỞ ĐẦU


Cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitagawa) là loài thảo dược lâu năm được sử dụng trong rất nhiều đơn thuốc tại Nhật Bản và nhiều quốc gia châu Á trong đó có Việt Nam. Cây đương quy Nhật Bản được trồng rộng rãi tại châu Á nhờ vào bộ rễ có chứa nhiều hợp chất có tính dược liệu cao và các lá non có thể ăn được (Ninh và cộng sự, 2006). Chỉ tính riêng tại Nhật Bản, sản lượng rễ đương quy Nhật Bản năm 2005 đạt xấp xỉ 197 tấn trong khi nhu cầu thực sự là vào khoảng 450 tấn hoặc nhiều hơn. Do đó, một lượng lớn rễ đương quy Nhật Bản trồng tại Trung quốc được nhập vào Nhật Bản (Fukuda và cs, 2009).

Cây đương quy Nhật Bản được trồng tại Việt Nam từ những năm 1990 để thu hoạch rễ dùng làm nguồn nguyên liệu thô cho ngành công nghiệp sản xuất dược liệu. Thời gian trồng cây đương quy Nhật Bản tại Nhật Bản là 2 năm để thu được rễ trưởng thành trong khi tại Việt Nam, do rất nhiều yếu tố bất lợi, thời gian trồng cây chỉ là 1 năm, do đó, sản lượng thấp (Phạm Văn Ý, 2000). Trong suốt quá trình phát triển, cây đương quy Nhật Bản chịu tác động rất lớn từ các yếu tố môi trường chẳng hạn như sự tấn công của sâu bệnh và côn trùng ảnh hưởng trực tiếp đến sản lượng và chất lượng. Khả năng sản xuất thấp cũng như các điều kiện tự nhiên không thuận lợi đã hạn chế việc mở rộng diện tích trồng cây đương quy Nhật Bản. Chính vì vậy, tại Việt Nam, 80% lượng rễ đương quy Nhật Bản được nhập từ Trung Quốc (Viện dược liệu, 2000).

Bên cạnh những khó khăn trong vấn đề canh tác, một trong những lý do khiến giống cây thuốc quý này đang mất dần đi tại Việt Nam là do chất lượng giống không đồng nhất và thiếu hụt. Cây đương quy Nhật Bản hiện nay vẫn được trồng bằng phương pháp gieo hạt. Tuy nhiên, hạt đương quy Nhật Bản được gieo trồng tốt nhất là trong điều kiện lạnh và phải gieo ngay sau khi hạt được thu hoạch bởi vì khả năng sống rất ngắn và mất đi sức nảy mầm nhanh chóng của chúng (Huxley, 1992).
Từ những lý do trên, đề tài: “Khảo sát sự tăng trưởng in vitro của cây đương quyNhật Bản (Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitagawa) dưới tác động của một số yếu tố hóa học và vật lý” đã được tiến hành nhăm tim ra biện pháp nhân giống loài cây này để tạo ra nguồn giống lớn, đồng nhất, đồng thời tìm ra môt sô điều kiện tối ưu để gia tăng sự tăng trưởng của cây đương quy Nhật Bản. Bên cạnh đó, một số chỉ tiêu sinh lý cũng được nghiên cứu nhằm giúp hiểu rõ hơn sự tăng trưởng của cây trong các điều kiện in vitro khác nhau.