Tiến Sĩ Khảo sát sự đa dạng di truyền của nhóm vi khuẩn tích lũy poly-phosphate trong chất thải chăn nuôi he

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NĂM 2015
MỤC LỤC vii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU .1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu . 2
1.2.2 Nội dung nghiên cứu . 2
1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 3
1.4 Cách tiếp cận và giả thuyết khoa học 3
1.5 Kết cấu của luận án 5
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .6
2.1 Các dạng phốtpho tồn tại trong tự nhiên 6
2.2 Sự tích tụ P sinh học trong các lớp bùn trầm tích ở ao-hồ . 7
2.3 Tình hình chăn nuôi heo, cá tra ở ĐBSCL 8
2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về phân lập, tuyển chọn PAB 11
2.4.1 Ngoài nước 11
2.4.2 Trong nước 13
2.5 Thành phần quần xã vi khuẩn tích lũy poly-phosphate . 14
2.5.1 Tình hình nghiên cứu thành phần quần xã PAB trong nước thải 14
2.5.2 Tình hình nghiên cứu thành phần quần xã PAB trong các ao hồ tự nhiên 15
2.6 Phương pháp định tính và định lượng hàm lượng poly-P nội bào 16
2.6.1 Định tính hạt poly-P nội bào . 16
2.6.1.1 Kính hiển vi quang học huỳnh quang 16
2.6.1.2 Kính hiển vi điện tử kết hợp với phân tích năng lượng phân tán 17
2.6.2 Xác định hàm lượng poly-P nội bào . 18
2.7 Cơ chế quá trình trao đổi chất của nhóm vi khuẩn PAB và sự điều hòa . 21
2.7.1 Cơ chế quá trình trao đổi chất của vi khuẩn tích lũy poly-P 21
2.7.2 Quá trình tổng hợp và điều hòa sự tổng hợp poly-phosphate 23
2.7.2.1 Các enzyme tham gia tổng hợp poly-P 24
2.7.2.2 Các enzyme tham gia phân giải poly-P . 24
2.7.2.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa hàm lượng carbon và phosphate . 25
2.7.2.4 Ảnh hưởng pH và Mg2+ trên quá trình đồng hóa và dị hóa . 27
2.8 Cơ sở khoa học phân tích sự đa dạng di truyền ở vi khuẩn . 28
2.8.1 Phân tích mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự gen 16S rRNA . 28
2.8.1.1 Gen rRNA trong phân tích mối quan hệ di truyền của vi khuẩn . 28
2.8.1.2 16S Ribosomal RNAs 30
2.8.1.3 Phân tích mối quan hệ di truyền dựa trên gen 16S rRNA . 30
2.8.2 Gen ppk1 trong phân tích mối quan hệ di truyền của PAB 32
2.8.3 Phân tích đa dạng di truyền 33
2.8.3.1 Đa dạng trình tự Nucleotide . 33
2.8.3.2 Đa dạng loài . 34
2.9 Các biện pháp loại bỏ phosphate hòa tan trong nước 35
2.9.1 Loại bỏ phốt-pho hòa tan bằng con đường hóa học . 35
2.9.2 Loại bỏ phốt-pho hòa tan bằng con đường sinh học 37
2.9.2.1 Quá trình loại bỏ phosphate trong hệ thống xử l ý nước thải . 38
2.9.2.2 Sự kết hợp loại bỏ phosphate bằng hóa học và sinh học . 41
2.9.2.3 Sự giống nhau giữa poly-P trong bùn hoạt tính và bùn lắng tụ . 42


CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 44
3.1 Phương tiện nghiên cứu . 44
3.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 44
3.1.2.1 Thời gian nghiên cứu . 44
3.1.2.2 Địa điểm nghiên cứu 44
3.1.3 Thiết bị, hóa chất 44
3.1.3.1 Thiết bị, dụng cụ 44
3.1.3.2 Hóa chất . 45
3.2 Phương pháp nghiên cứu . 47
3.2.1 Chuẩn bị mẫu 47
3.2.1.1 Đối với mẫu chất thải ao nuôi thâm canh cá tra 47
3.2.1.2 Đối với mẫu chất thải trại heo [sau hầm ủ biogas] 48
3.2.2 Phân lập vi khuẩn 49
3.2.3 Định tính hạt poly-P nội bào . 50
2.2.4 Xác định hàm lượng poly-P nội bào . 50
3.2.5 Nhận diện gen ppk1 51
3.2.6 Định danh PAB . 52
3.2.7 Phân tích sự đa dạng vi khuẩn tích lũy poly-P . 53
3.2.8 Thí nghiệm kiểm tra sơ bộ khả năng loại bỏ phosphate hòa tan 54
3.2.9 Thí nghiệm theo dõi sự biến đổi pH, OD.600nm . 54
3.2.10 Thí nghiệm kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate qui mô 10 lít . 56
3.2.11 Thí nghiệm kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate qui mô 500 lít . 57
3.2.12 Đánh giá hiệu quả xử lý của 2 dòng vi khuẩn PAB 58
3.2.13 Phương pháp xử lý số liệu 60


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .61
4.1 Phân lập và xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn phân lập . 61
4.1.1 Kết quả phân lập . 61
4.1.2 Đặc điểm các dòng vi khuẩn đã phân lập . 64
4.1.3 Mô tả đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn PAB . 66
4.1.4 Nhận diện gen ppk1 77
4.2 Định danh và phân tích tính đa dạng PAB 80
4.2.1 Định danh và phân tích sự phát sinh loài PAB trong ao nuôi cá tra . 80
4.2.2 Định danh và phân tích sự phát sinh loài PAB chất thải chăn nuôi heo. 83 4.2.3 Phân tích tính đa dạng di truyền của PAB 92
4.2.3.1 Phân tích tính đa dạng nucleotide 92
4.2.3.2 Phân tích tính đa dạng loài . 103
4.3 Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P . 104
4.3.1 Kết quả kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate của 20 dòng vi khuẩn .104
4.3.2 Sự biến đổi chỉ số pH và hàm lượng PO43- theo thời gian 105
4.3.3 Sự biến đổi chỉ số OD.600 nm và hàm lượng PO43- theo thời gian 106
4.3.4 Kết quả loại bỏ phosphate trong nước ao nuôi cá tra . 110
4.3.4.1 Sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian qui mô 10 lít 110
4.3.4.2 Sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian qui mô 500 lít 112
4.3.4.3 Đánh giá hiệu quả xử lý PO43- vi khuẩn mô hình nuôi cá tra 113


CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 120
5.1 Kết luận 120
5.2 Đề nghị . 121
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 122
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ . 136
PHỤ LỤC 1
: ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN PHÂN LẬP . 137
Bảng P
L1.1: Chỉ số pH và mật số vi khuẩn dị dưỡng của 196 mẫu 137
Bảng P
L1.2: Hình dạng 439 dòng vi khuẩn và hàm lượng poly-P nội bào . 147
PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S RNA 156
PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ CHỈ SỐ ĐA DẠNG . 159
PL3.1: Phân tích sự đa dạng nucleotide giữa 48 dòng 159
PL3.2: Phân tích sự đa dạng nucleotide giữa 22 dòng . 159
PL3.3: Phân tích sự đa dạng nucleotide giữa 26 dòng 160
PHỤ LỤC 4: BẢNG THỐNG KÊ SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM . 161
PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ANOVA . 163


CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Ngành nuôi trồng thủy sản, chăn nuôi gia súc ở ĐBSCL đã và đang phát
triển theo hướng chăn nuôi tập trung và kết quả của xu thế đổi mới là làm tăng
cường hiệu quả sản xuất trên một đơn vị lao động và đất đai. Bên cạnh sự phát
triển đó là những nguy cơ ảnh hưởng mạnh mẽ đến môi trường sống. Các
nguồn gây ô nhiễm nước chủ yếu là thức ăn tồn đọng, chất thải bài tiết của cá
và heo Thành phần các chất gây ô nhiễm chủ yếu là protein, lipid, acid béo,
phospholipid, carbohydrate, hàm lượng nitơ, chất khoáng (Lê Văn Cát,
2007). Thông qua quá trình phân hủy của vi sinh vật và các tiến trình phân hủy
tự nhiên, lượng thức ăn dư thừa và chất thải sẽ chuyển thành các dạng nitơ
(N) và phốt-pho (P) vô cơ. Hàm lượng N và P vô cơ cao trong môi trường
nước sẽ kích thích mạnh mẽ khả năng tăng sinh khối của thủy sinh vật như tảo
và vi khuẩn lam là nhân tố chủ yếu gây ra hiện tượng phú dưỡng hóa và tiến
trình phân hủy tảo sẽ làm cho môi trường nước ao bị ô nhiễm, thiếu oxy cung
cấp cho hoạt động hô hấp của cá, cá sẽ suy yếu và dễ nhiễm bệnh.
Để xử l ý phốt-pho hòa tan, một số biện pháp được sử dụng là xử lý bằng



hóa học và sinh học. Trong biện pháp xử lý bằng sinh học, nhóm
vi khuẩn cókhả năng hấp thu và tồn trữ P như nguồn phốt-pho nội bào giữ vai trò quan
trọng và chúng được xem như là vi khuẩn tích lũy poly-phosphate. Loại bỏ
phốt-pho hoà tan dạng PO43- thông qua hoạt động vi khuẩn ngày càng được
ứng dụng bởi vì các đặc tính hữu dụng của chúng là dễ ứng dụng, hiệu quả về
mặt kinh tế và thân thiện với môi trường sống (Mino et al., 1998).
Các nghiên cứu trên thế giới về thành phần quần xã vi khuẩn tích lũy
poly-phosphate bằng cách sử dụng các phương pháp mô tả truyền thống và kỹ
thuật sinh học phân tử hiện đại cho thấy quần xã vi khuẩn tích lũy pol
yphosphate có sự đa dạng về thành phần loài kể cả trong các hệ thống xử lý
nước thải và trong các ao-hồ tự nhiên. Sự hiện diện của các loài và thành phần
phần trăm của chúng trong môi trường cũng có sự khác nhau giữa 2 hệ sinh
thái: nhân tạo (hệ thống xử lý nước thải) và tự nhiên (ao-hồ). Tuy nhiên, chúng
chủ yếu thuộc các lớp Bacilli, Alpha-proteobacteria, Beta-proteobacteria,
Gamma-proteobacteria và Actinobacteria (Crocetti et al., 2000; Ahn et al.,
2007; Bond et al., 1995, Beer et al., 2006; Szabó et al., 2011). Việc phân lập,
định danh vi khuẩn tích lũy poly-P bằng kỹ thuật sinh học phân tử có vai trò
quan trọng không chỉ để ứng dụng chúng trong quá trình xử lý phốt-pho hòa
tan mà còn hỗ trợ trong việc đánh giá sự phân bố và tính di truyền quần thể
của chúng. Hiện nay chưa có nghiên cứu về thành phần quần xã vi khuẩn tích lũy
poly-phosphate trong nước và bùn của ao nuôi thâm canh cá tra (sau đây gọi là
chất thải ao nuôi cá tra) và chất thải chăn nuôi heo đã qua xử lý biogas (sau
đây gọi là chất thải chăn nuôi heo) ở ĐBSCL. Tuy nhiên, Phan et al., (2009)
nghiên cứu sự tích lũy các thành phần dinh dưỡng trong ao nuôi cá tra ở
ĐBSCL cho thấy khoảng 51% P được tích lũy trong bùn đáy. Điều này cho
thấy có sự đóng góp của vi sinh vật trong quá trình tích tụ P hòa tan. Chúng
hấp thu PO43- hòa tan trong nước và tích lũy chúng trong sinh khối trước khi
lắng tụ xuống đáy ao. Chính vì vậy việc phân lập, tuyển chọn vi khuẩn tích lũy
poly-P có hiệu suất loại bỏ phosphate cao sẽ tạo nên cơ sở dữ liệu cho đánh
giá tính đa dạng sinh học của PAB (Poly-phosphate accumulating bacteria-vi
khuẩn tích lũy poly-P); là một nghiên cứu cần thiết nhằm đưa các giải pháp
khai thác và sử dụng bền vững nguồn vi khuẩn tích lũy poly-phosphate bản
địa, có lợi trong tự nhiên để ứng dụng vào trong xử lý P hòa tan dư thừa trong
nước.
1.2 Mục tiêu và nội dung
nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá sự đa dạng sinh học của nhóm vi khuẩn có khả năng tích lũy
poly-P với hàm lượng cao được phân lập từ chất thải chăn nuôi heo và cá tra ở
các tỉnh ĐBSCL để tìm hiểu sự phân bố và tính di truyền quần thể của chúng.
Tìm ra nguồn vi khuẩn có khả năng loại bỏ phosphate cao làm cơ sở cho
việc sản xuất chế phẩm sinh học xử lý phốt-pho hòa tan.
Ứng dụng các dòng vi khuẩn phân lập được để xử lý phốt-pho hòa tan
trong nước ao cá tra ở qui mô phòng thí nghiệm.
1.2.2 Nội dung nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P từ các nguồn thải của trại chăn nuôi
heo và ao cá tra của 13 tỉnh ĐBSCL từ đó tuyển chọn các dòng có hiệu quả
tích lũy poly-P cao.
Xây dựng cây phả hệ các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P được phân lập
dựa trên trình tự gen 16S rRNA từ đó phân tích sự đa dạng di truyền dựa trên
các chỉ số đa dạng sinh học.
Đánh giá khả năng xử lý phốt-pho hòa tan trong nước ao cá tra của các
dòng vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập được thông qua qui mô thử nghiệm chế
phẩm này (ở phòng thí nghiệm với qui mô là 500 lít).