Luận Văn “KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Rhizoctonia solani GÂY BỆNH TRÊN CÂY BÔNG VẢI Ở VIỆT NAM”

iv


TÓM TẮT


“KHẢO


SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Rhizoctonia solani GÂY BỆNH


TRÊN CÂY BÔNG VẢI Ở VIỆT NAM”


Đề tài được thực hiện trên đối tượng là nấm Rhizoctonia solani gây bệnh trên


cây bông vải ở Việt Nam. Đây là tác nhân chính gây ra các bệnh như: lở cổ rễ, chết rụi


cây con, bệnh đốm cháy lá gây ra những thiệt hại đáng kể và ảnh hưởng rất lớn tới


năng suất của các cánh đồng trồng bông vải ở Việt Nam. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật


PCR – RFLP và giải trình tự vùng ITS-rDNA nhằm mục tiêu khảo sát sự đa dạng về


di truyền của 12 dòng R. solani gây bệnh trên cây bông vải ở Việt Nam, từ đó dễ dàng


cho việc đưa ra các biện pháp phòng trừ có hiệu quả các bệnh do nấm này gây ra. Đề


tài được thực hiện tại phòng thực tập bệnh cây khoa Nông Học, và Trung tâm Phân


tích Thí Nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, từ 13/02/2006


đến 15/08/2006.


Nội dung nghiên cứu:


Phục hồi 12 dòng nấm R. solani gây bệnh trên cây bông vải ở Việt Nam.


Nhân sinh khối 12 dòng nấm R. solani.


Ly trích DNA của các dòng nấm R. solani.


Khuếch đại vùng ITS-rDNA của 12 dòng nấm bằng phản ứng PCR với cặp


primer ITS4 - ITS5.


Tiến hành phản ứng cắt vùng ITS-rDNA sau khi khuếch đại bằng 2 enzyme cắt


giới hạn HaeIII, TaqI.


Phân tích sự đa dạng về di truyền của 12 dòng nấm dựa trên kết quả RFLP.


Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR theo phương pháp cắt gel để đọc trình tự các


dòng nấm R. solani.


Tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR vùng ITS-rDNA sau khi tinh sạch bằng


cặp primer ITS1 - ITS4.

v


Phân tích kết quả đọc trình tự và vẽ cây phân nhánh di truyền.


Kết quả thu được:


Phục hồi, nhân sinh khối và ly trích được DNA của 12 dòng nấm R. solani gây


bệnh trên cây bông vải.


Khuếch đại thành công vùng ITS-rDNA của 12 dòng nấm R. solani trên bằng


phản ứng PCR, sản phẩm PCR có kích thước khoảng 720 bp.


Đã tiến hành cắt sản phẩm PCR vùng ITS-rDNA bằng hai enzyme giới hạn


HaeIII, TaqI. Kết quả, không nhận thấy có sự đa dạng về mặt di truyền trên 12 dòng


nấm R. solani thu thập trên cây bông vải khi cắt bằng hai enzyme này.


Đã tiến hành đọc trình tự và so sánh vùng ITS1 của 8 dòng nấm với nhau và với


các dòng nấm trên cơ sở dữ liệu NCBI. Kết quả 8 dòng nấm này được chia làm 3


nhóm:


 Nhóm 1: BV-50-01, BV-71-02.


 Nhóm 2: BV-62-02, BV-62-03.


 Nhóm 3: BV-61-04, BV-61-05, BV-61-06, BV-62-01


Đã xác định được nhóm tiếp hợp của hai dòng BV-50-01 và BV-62-02 là AG-1-IA và


AG-4.


Như vậy, đã có sự đa dạng về mặt di truyền giữa 12 dòng nấm R. solani gây


bệnh trên cây bông vải ở Việt Nam.

vi


MỤC LỤC


PHẦN TRANG


Trang bìa


Trang tựa


Lời cảm ơn iii


Tóm tắt iv


Mục lục . vi


Danh sách các hình . ix


Danh sách các bảng . x


Danh sách chữ viết tắt xi


Phần I. MỞ ĐẦU . 1


1.1. Đặt vấn đề . 1


1.2. Mục tiêu 2


1.3. Yêu cầu đề tài . 2


1.4. Giới hạn đề tài 2


Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3


2.1. Giới thiệu về nấm Rhizoctonia solani . 3


2.1.1. Đặc điểm hình thái . 3


2.1.2. Đặc điểm sinh lý 4


2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy . 4


2.2. Điều kiện phát sinh bệnh và phạm vi ký chủ . 4


2.3. Sự phân nhóm của nấm R. solani . 4


2.4. Giới thiệu sơ lược về cây bông vải . 6


2.4.1. Triệu chứng bệnh trên cây bông vải do nấm R. solani gây ra . 7


2.4.1.1. Bệnh lở cổ rễ 7


2.4.1.2. Bệnh chết rụi cây con . 7


2.5. Các phương pháp được ứng dụng trong sinh học phân tử . 8


2.5.1. Phương pháp PCR . 8


2.5.1.1. Nguyên tắc của phương pháp PCR 8

vii


2.5.1.2. Các thành phần cần thiết để thực hiện phản ứng PCR . 8


2.5.1.3. Thực hiện phản ứng PCR . 9


2.5.1.4. Các nhân tố ảnh hưởng tới phản ứng PCR . 9


2.5.1.5. Lợi ích của phản ứng PCR . 10


2.5.2. Phương pháp RFLP . 10


2.5.2.1. Restriction endonuclease 10


2.5.2.2. Quy trình phương pháp RFLP 11


2.5.3. Phương pháp đọc trình tự 12


2.5.3.1. Nguyên tắc phương pháp đọc chuỗi mã Sanger . 12


2.5.3.2. Nguyên tắc giải trình tự bằng máy Sequencer . 12


2.5.3.3. Đọc trình tự sản phẩm PCR 12


2.5.4. Một số phương pháp được sử dụng trong xây dựng cây phả hệ 12


2.5.4.1. Phương pháp Neighbor – Joining . 12


2.5.4.2. Phương pháp Maximum Parsimony . 13


2.5.4.3. Phương pháp Bootstrap 13


2.6. Cơ sở của việc sử dụng vùng ITS-rDNA trong nghiên cứu sự đa dạng di


truyền của nấm R. solani 13


2.6.1. Giới thiệu về vùng rDNA 13


2.6.2. Sử dụng vùng rDNA để nghiên cứu sự đa dạng di truyền 15


2.7. Một số nghiên cứu trong nước và ngoài nước về sự đa dạng


di truyền của nấm R. solani . 16


2.7.1. Nghiên cứu trong nước 16


2.7.2. Nghiên cứu ngoài nước 16


Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP 19


3.1. Thời gian địa điểm 19


3.2. Nội dung đề tài . 19


3.3. Nguồn nấm R. solani 19


3.4. Phương pháp tiến hành . 19


3.4.1. Phục hồi và nhân sinh khối nấm R. solani . 19


3.4.2. Ly trích DNA tổng số của nấm R. solani 20

viii


3.4.3. Khuếch đại vùng ITS-rDNA của các dòng nấm R. solani 23


3.4.4. Điện di và đọc kết quả PCR trên gel agarose 24


3.4.5. Các bước thực hiện phản ứng đọc trình tự 25


3.4.5.1. Chuẩn bị khuôn DNA . 25


3.4.5.2. Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator V3.3


Cycle Sequencing Kit 26


3.4.5.3. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại 26


3.4.5.4. Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy


sequence ABI PRISM 3100 27


3.4.6. Phân tích RFLP vùng ITS-rDNA của các dòng nấm R. solani . 27


Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28


4.1. Phục hồi và nhấn sinh khối nấm . 28


4.2. Ly trích DNA tổng số của nấm 28


4.3. Pha loãng DNA tổng số 29


4.4. Tiến hành phản ứng PCR . 30


4.5. Phân tích RFLP vùng ITS-rDNA của các dòng nấm R. solani 34


4.6. Đọc trình tự sản phẩm PCR 38


Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46


5.1. Kết luận 46


5.2. Đề nghị . 46


Phần VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 47


Phần VII. PHỤ LỤC . 49