Luận Văn Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus ni

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASE TỪ NẤM
Aspergillus niger VÀ Mucor TRÊN MÔI
TRƯỜNG LÊN MEN BÁN RẮN


TÓM TẮTEnzyme amylase là một enzyme có thể tìm thấy ở rất nhiều sinh vật. Hiện nay, ezyme này được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như nông nghiệp, công nghiệp và y học. Mục tiêu đề tài là nghiên cứu khả năng tạo enzyme amylase của nấm Aspergillus niger và Mucor và những yếu tố tác động đến khả năng tạo amylase của chúng. Đề tài đã thu được một số kết quả về sự tác động của các yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase từ nấm Aspergillus niger và Mucor.
Aspergillus niger khi sinh trưởng và tổng hợp enzyme amylase trên môi trường bán rắn với cơ chất là cám gạo bổ sung thêm trấu và bã đậu nành chịu tác động của rất nhiều yếu tố môi trường như tỷ lệ cơ chất, pH môi trường, thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ dinh dưỡng và tỷ lệ giống. Đề tài đã nghiên cứu sự tác động của các yếu tố môi trường nêu trên đầu tiên là ở mức độ riêng lẻ từng yếu tố, sau đó là sự tương tác qua lại của những yếu tố có ảnh hưởng mạnh đến sự tổng hợp enzyme. Kết quả thu được cho thấy với những môi trường có tỷ lệ Cám gạo: trấu: bã đậu nành (2:1:1), pH 5, thời gian nuôi cấy là 28 giờ, nhiệt độ 35[SUP]0[/SUP]C, độ ẩm 55%, 2 lần nồng độ dinh dưỡng, tỷ lệ giống 0,8*10[SUP]8[/SUP] bt/g là tối ưu cho Aspergillus niger sinh tổng hợp amylase.
Khả năng tổng hợp enzyme amylase từ Mucor khi sinh trưởng trên môi trường bán rắn với cơ chất là cám gạo bổ sung thêm trấu và bã đậu nành chịu tác động của rất nhiều yếu tố môi trường như tỷ lệ cơ chất, pH môi trường, thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ dinh dưỡng và tỷ lệ giống. Đề tài đã nghiên cứu sự tác động của các yếu tố môi trường nêu trên đầu tiên là ở mức độ riêng lẻ từng yếu tố, sau đó là sự tương tác qua lại của những yếu tố có ảnh hưởng mạnh đến sự tổng hợp enzyme. Kết quả thu được cho thấy với những môi trường có tỷ lệ Cám gạo: trấu: bã đậu nành (2:1:1), pH 5, thời gian nuôi cấy là 32 giờ, nhiệt độ 30[SUP]0[/SUP]C, độ ẩm 55%, 3 lần nồng độ dinh dưỡng, tỷ lệ giống 1,6*10[SUP]8[/SUP] bt/g là tối ưu cho Mucor sinh tổng hợp amylase.

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN iii
TÓM TẮT iv
SUMMARY v
MỤC LỤC vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT x
DANH SÁCH CÁC HÌNH xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG xii
Chương 1 MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề. 1
1.2. Yêu cầu. 2
1.3. Nội dung . 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu sơ lược về enzyme. 3
2.1.1. Khái niệm chung về enzyme. 3
2.1.2. Tính chất ưu việt của enzyme. 3
2.2. Tổng quan về enzyme amylase. 4
2.2.1. Amylase. 4
2.2.2. Phân loại 4
2.2.3. Đặc tính và cơ chế tác dụng của 3 loại amylase thông dụng. 4
2.2.3.1. α-amylase. 4
2.2.3.2. β-amylase. 5
2.2.3.3. γ-amylase. 6
2.2.4. Nguồn thu nhận. 6
2.2.4.1. Thực vật 6
2.2.4.2. Vi sinh vật 7
2.2.5. Ứng dụng. 7
2.2.5.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 7
2.2.5.2. Trong công nghiệp dệt, giấy. 8
2.2.5.3. Trong y học. 8
2.2.5.4. Trong nông nghiệp. 9
2.2.5.5. Trong công nghệ tẩy rửa. 9
2.2.6. Cơ chất của enzyme amylase. 9
2.2.6.1. Tinh bột 9
2.2.6.2. Glycogen. 11
2.3. Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus niger và Mucor. 12
2.3.1. Nấm mốc Aspergillus niger. 12
2.3.2. Nấm mốc Mucor. 13
2.4. Nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp amylase. 14
2.4.1. Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng. 14
2.4.2. Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng. 14
2.4.2.1. Nguồn carbon. 14
2.4.2.2. Nguồn Nitơ. 14
2.4.2.3. Các nguyên tố khoáng. 15
2.4.2.4. Nhiệt độ nuôi cấy. 16
2.4.2.5. pH ban đầu. 16
2.4.2.6. Độ ẩm 16
2.4.2.7. Môi trường không khí 16
2.5. Môi trường lên men bán rắn. 16
2.5.1. Cám gạo. 16
2.5.2. Bã đậu nành. 18
2.6. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sản xuất enzyme. 18
2.6.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt 18
2.6.2. Phương pháp nuôi cấy chìm 19
2.7. Thu nhận enzyme từ môi trường nuôi cấy bề mặt 20
2.7.1. Trích ly enzyme từ môi trường nuôi cấy bề mặt 20
2.7.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình li trích. 20
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm 21
3.2. Vật liệu thí nghiệm 21
3.2.1. Đối tượng thí nghiệm 21
3.2.2. Cơ chất 21
3.2.3. Hóa chất và thiết bị 21
3.2.3.1. Hóa chất 21
3.2.3.2. Thiết bị 21
3.3. Phương pháp nghiên cứu. 21
3.3.1. Phương pháp cấy truyền. 21
3.3.2. Phương pháp nhân giống cấp 2. 23
3.3.3. Phương pháp mô tả hình thái A. niger và Mucor. 24
3.3.3.1. Quan sát hình thái đại thể. 24
3.3.3.2. Quan sát hình thái vi thể. 24
3.3.4. Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm sợi bằng buồng đếm hồng cầu. 24
3.3.5. Phương pháp xác định độ ẩm 25
3.3.6. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzyme amylase. 26
3.3.7. Phương pháp xác định hàm lượng amylase. 27
3.3.8. Phương pháp xác định hoạt tính amylase. 29
3.3.9. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 30
3.3.10. Phương pháp bố trí và xử lí số liệu thí nghiệm 30
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
4.1. Khả năng sinh tổng hợp amylase của nấm mốc Aspergillus niger. 31
4.1.1. Nấm mốc A. niger. 31
4.1.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo: bã đậu nành: trấu. 31
4.1.3. Ảnh hưởng của pH 33
4.1.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy. 35
4.1.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ. 36
4.1.6. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu. 38
4.1.7. Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng. 39
4.1.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống. 40
4.2. Khả năng sinh tổng hợp amylase của nấm mốc Mucor. 42
4.2.1. Nấm mốc Mucor. 42
4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo: bã đậu nành: trấu. 43
4.2.3. Ảnh hưởng của pH 44
4.2.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy. 45
4.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ. 47
4.2.6. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu. 49
4.2.7. Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng. 50
4.2.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống. 52
4.3. Qui hoạch thực nghiệm 53
4.3.1. Xác định giá trị tối ưu của một số yếu tố ảnh hưởng. 53
4.3.1.1. Xác định giá trị tối ưu của một số yếu tố ảnh hưởng đến A. niger. 53
4.3.1.2. Xác định giá trị tối ưu của một số yếu tố ảnh hưởng đến Mucor. 58
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ. 63
5.1. Kết luận. 63
5.2. Đề nghị 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO 64
PHỤ LỤC

Chương 1MỞ ĐẦU1.1. Đặt vấn đềEnzyme là một loại protein đặc biệt được sinh vật tổng hợp nên và tham gia các phản ứng sinh học, là thành phần không thể thiếu trong mọi tế bào sinh vật. Chúng đóng vai trò quyết định mối quan hệ giữa cơ thể sống và môi trường sống.
Enzyme amylase có vai trò rất quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp và chữa trị bệnh, như công nghiệp thực phẩm, dệt, tẩy rửa, chữa bệnh kém tiêu hóa ở người và trong ngành chế biến thức ăn gia súc
Cuối thế kỉ 19 và suốt thế kỉ 20, ngành công nghiệp sản xuất enzyme đã rất phát triển, ngày càng thiên về xu hướng sản xuất enzyme dựa vào hoạt động sống của vi sinh vật vì nhiều lợi ích thiết thực. Công nghệ sản xuất enzyme đã và đang mang lại những nguồn lợi lớn cho nhiều quốc gia trên thế giới.
Hiện nay, doanh thu từ việc sản xuất enzyme lên đến hơn 1,7 tỷ USD, trong đó góp phần không nhỏ là lợi nhuận thu được từ enzyme amylase. Thị trường enzyme công nghệ sẽ còn tiếp tục gia tăng trong tương lai đến. Ở nước ta, nhu cầu sử dụng các chế phẩm enzyme trong đó có amylase trong chế biến thực phẩm, thức ăn gia súc và trong các ngành công nghiệp khác ngày càng nhiều. Vì vậy, hằng năm, nước ta phải nhập khẩu lượng lớn những nguồn enzyme này.
Ngày nay, việc tận dụng phế liệu trong công, nông nghiệp làm nguồn carbon để sản xuất amylase bởi vi sinh vật bằng phương pháp lên men chìm và lên men bán rắn rất được quan tâm ở nước ta và nhiều nước trên thế giới. Việt Nam là một nước nhiệt đới có nền nông nghiệp lâu đời và đa dạng, đang trên đà phát triển. Vì vậy lượng phế phẩm nông nghiệp thải ra ngày càng gia tăng, như cám gạo, bã đậu nành là nguồn cung cấp carbon thích hợp để cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp amylase bằng phương pháp lên men bám rắn. Mặc khác, đây là cơ chất khá rẻ tiền và ổn định có tiềm năng sử dụng để sản xuất amylase ở qui mô lớn.
Hiện nay, viện công nghệ sinh học nhiệt đới có một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase khá cao, trong đó có chủng Aspergillus niger và Mucor. Tuy nhiên, để thu được enzyme amylase có hiệu suất cao chỉ cần chủng vi sinh vật có khả năng tạo ezyme amylase cao là chưa đủ. Các vi sinh vật đó cần phải được nuôi trên môi trường cơ chất thích hợp có khả năng cảm ứng kích thích chúng sinh amylase. Môi trường nuôi cấy cần được bổ sung thêm những nồng độ dinh dưỡng và các vi sinh vật phải được nuôi ở nhiệt độ thích hợp. Cuối cùng, thời gian thu nhận dịch chiết enzyme từ canh trường nuôi cấy cũng sẽ ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng và hoạt tính amylase thu được.
Trên cơ sở đó, chúng tôi chọn đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus niger và Mucor trên môi trường lên men bán rắn” nhằm xây dựng điều kiện môi trường tối ưu cho hai chủng nghiên cứu tạo enzyme nhiều và có hoạt tính cao cũng như điều kiện để thu nhận enzyme tốt nhất. Đề tài đã được thực hiện tại phòng các chất có hoạt tính sinh học - viện Sinh Học Nhiệt Đới, thành phố Hồ Chí Minh.
1.2. Yêu cầu
- Xác định các giá trị tối ưu của các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của hai chủng thí nghiệm.
- Xác định mối tương quan giữa các yếu tố môi trường có tác động mạnh đến khả năng tổng hợp amylase của hai chủng thí nghiệm.
1.3. Nội dung
- Khảo sát khả năng tổng hợp amylase của hai chủng thí nghiệm.
- Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố như tỷ lệ cơ chất, độ ẩm, nhiệt độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, pH môi trường ban đầu, nồng độ dinh dưỡng, và tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp amylase của hai chủng thí nghiệm.
- Tối ưu hóa các yếu tố trên bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm nhằm tìm ra điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường tối ưu cho hai chủng trên sinh ra lượng amylase cao.