Thạc Sĩ Khảo sát một số tác dụng dược lý của các cao chiết và saponin chiết từ thân rễ cây Cát lồi (Costus s

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Tp. HCM, Tháng 9 – 2012


MỤC LỤC ( Luận văn dài 110 trang có File WORD)


MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . v
DANH MỤC BẢNG .vii
DANH MỤC HÌNH viii
ĐẶT VẤN ĐỀ ix

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN . 1

1.1. Giới thiệu về Cát lồi 1

1.1.1. Phân loại – mô tả . 1

1.1.2. Phân bố - sinh thái . 1

1.1.3. Thành phần hóa học và các hợp chất trong thân rễ Cát lồi . 2

1.1.4. Tính vị - công dụng theo y học cổ truyền 3

1.1.5. Tác dụng của Cát lồi trên thực nghiệm 4

1.1.6. Tác dụng kiểu estrogen của Cát lồi . 4

1.1.7. Tác dụng giảm đường huyết của Cát lồi 5

1.2. Estrogen . 5

1.2.1. Giới thiệu . 5

1.2.2. Sự điều hòa hormone thông qua trục H-P-G . 6

1.2.2.1. Sự điều hòa hormone trong chu kỳ kinh nguyệt 6

1.2.2.2. Sự điều hòa hormone trong dậy thì 7

1.2.3. Cơ chế hoạt động của estrogen 8

1.2.3.1. Cơ chế hoạt động ở mức độ phân tử 8

1.2.3.2. Các loại thụ thể estrogen 9

1.2.4. Một số tác dụng của estrogen 10

1.2.4.1. Tác dụng của estrogen trên tử cung . 10

1.2.4.2. Tác dụng của estrogen trên sự cân bằng glucose . 12

1.2.4.3. Tác dụng của estrogen trên các quá trình chuyển hóa khác 12

1.2.4.4. Tác dụng kháng oxy hóa của estrogen . 13



1.2.5. Thiếu hụt estrogen trong mãn kinh 13

1.2.5.1. Định nghĩa mãn kinh 13

1.2.5.2. Estrogen – Progesterone ở thời kỳ mãn kinh . 14

1.2.5.3. Hậu quả của mãn kinh . 15

1.2.5.4. Liệu pháp hormone thay thế 16

1.3. Phytoestrogen 16

1.3.1. Giới thiệu . 16

1.3.2. Cơ chế hoạt động của phytoestrogen . 17

1.3.3. Một số tác động của phytoestrogen . 18

1.3.3.1. Phytoestrogen và ER 18

1.3.3.2. Phytoestrogen và sự sinh tổng hợp steroid 19

1.3.3.3. Phytoestrogen và sự tăng trưởng- tăng sinh tế bào 20

1.3.3.4. Phytoestrogen và đái tháo đường . 20

1.3.4. Diosgenin . 21

1.3.5. Các phương pháp đánh giá tác dụng estrogen của phytoestrogen . 22

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP . 24

2.1. Nguyên liệu và phương pháp chiết xuất 24

2.2. Đối tượng nghiên cứu 24

2.3. Thiết bị - hóa chất 25

2.3.1. Thiết bị . 25

2.3.2. Hóa chất . 25

2.4. Phương pháp nghiên cứu . 26

2.4.1. Thử tinh khiết 26

2.4.1.1. Xác định độ ẩm trong dược liệu 26

2.4.1.2. Xác định độ tro 27

2.4.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 28

2.4.3. Định lượng saponin bằng phương pháp cân 29

2.4.4. Định lượng diosgenin trong dược liệu bằng HPLC-MS . 30

2.4.5. Khảo sát độc tính cấp diễn đường uống và liều cho uống . 31



2.4.6. Phương pháp gây mô hình giảm năng sinh dục . 32

2.4.7. Khảo sát tác dụng kiểu estrogen 32

2.4.7.1. Phương pháp khảo sát chu kỳ động dục đầu tiên ở chuột non 33

2.4.7.2. Phương pháp khảo sát chu kỳ động dục 34

2.4.7.3. Phương pháp khảo sát trọng lượng tử cung (phương pháp Atswood). 35

2.4.7.4. Khảo sát nồng độ 17β-estradiol sử dụng kỹ thuật ELISA cạnh tranh . 36

2.4.7.5. Khảo sát thể trọng chuột 38

2.4.8. Khảo sát tác dụng giảm đường huyết 38

2.5. Phân tích thống kê . 40

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN . 41

3.1. Thử tinh khiết 41

3.1.1. Độ ẩm bột dược liệu và các cao chiết 41

3.1.2. Độ tro của bột dược liệu 41

3.2. Kết quả định tính và định lượng 41

3.2.1. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 41

3.2.2. Định lượng saponin toàn phần bằng phương pháp cân . 42

3.2.3. Định lượng diosgenin bằng HPLC-MS . 42

3.3. Khảo sát độc tính cấp diễn đường uống và liều cho uống 46

3.4. Tác dụng estrogen của Cát lồi . 46

3.4.1. Khảo sát trên giai đoạn động dục dương tính 46

3.4.1.1. Thời gian xuất hiện chu kỳ động dục đầu tiên ở chuột non . 46

3.4.1.2. Tỷ lệ động dục dương tính ở nhóm chuột trưởng thành bình thường . 47

3.4.1.3. Tỷ lệ động dục dương tính ở nhóm chuột giảm năng sinh dục . 49

3.4.2. Khảo sát tác dụng trên trọng lượng tử cung(-buồng trứng) . 50

3.4.2.1. Trọng lượng tử cung-buồng trứng ở nhóm chuột non . 50

3.4.2.2. Trọng lượng tử cung-buồng trứng ở nhóm chuột trưởng thành bình

thường . 51

3.4.2.3. Trọng lượng tử cung ở nhóm chuột giảm năng sinh dục . 52

3.4.3. Nồng độ 17β-estradiol trong huyết tương . 54



3.4.3.1. Kết quả đường chuẩn 17β-estradiol . 54

3.4.3.2. Kết quả nồng độ 17β-estradiol ở nhóm chuột giảm năng sinh dục . 54

3.4.4. Khảo sát thể trọng chuột trước và sau thử nghiệm 56

3.4.4.1. Thể trọng chuột trước và sau thử nghiệm ở nhóm chuột non 56

3.4.4.2. Thể trọng chuột trước và sau thử nghiệm ở chuột trưởng thành bình

thường . 56

3.4.4.3. Thể trọng chuột trước và sau thử nghiệm ở nhóm chuột giảm năng

sinh dục . 58

3.4.5. Bàn luận . 59

3.5. Tác dụng của Cát lồi trên mô hình giảm năng sinh dục-đường huyết cao 64

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 69

4.1. Kết luận . 69

4.1.1. Tác dụng estrogen 69

4.1.2. Tác dụng hạ đường huyết 69

4.2. Đề nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO . 71

PHỤ LỤC



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ANOVA Analysis of Variance

AQP Aquaporin

ArKO Aromatase Knock-out

BMI Body Mass Index

cAMP cyclic Adenosine Monophosphate DHEA-S Dehydroepiandrosterone - sulfate E2 17β-estradiol
EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay ER Estrogen Receptor
ERE Estrogen Response Element ERαKO Estrogen Receptor α Knock-out FSH Follicle-Stimulating Hormone GH Growth Hormone
GLUT2 Glucose Transporter 2

GLUT4 Glucose Transporter 4

GnRH Gonadotropin Releasing Hormone

GPR30 G-protein-coupled Receptor 30

H-P-G axis Hypothalamic-Pituitary-Gonadal axis

HDL High-density Lipoprotein

HPLC-MS High Perfomance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry

HRT Hormone Replacement Therapy

LDL Low-density Lipoprotein

LH Luteinizing Hormone

MAPK Mitogen-activated Protein Kinases

MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú Michigan Center Foundation 7

NR Nuclear Receptor



OECD Organisation for Economic Co-operation and Development

P4 Progesterone

SHBG Sex Hormone Binding Globulin

STZ Streptozotocin

T Testosterone

WHI Women’s Health Initiative



DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Nồng độ các loại hormone trong mãn kinh 14

Bảng 2.1: Các dấu hiệu của các giai đoạn khác nhau trong chu kỳ động dục của chuột. .33
Bảng 2.2: Thành phần tế bào và tính chất của chất nhờn âm đạo ở các giai đoạn

động dục 34

Bảng 2.3: Phân lô chuột trong mô hình giảm năng sinh dục-đường huyết cao 38

Bảng 3.1: Độ ẩm của dược liệu và các cao chiết 41

Bảng 3.2: Độ tro toàn phần và tro không tan trong acid của bột dược liệu 41

Bảng 3.3: Hàm lượng saponin trong bột dược liệu và cao tổng Cát lồi 42

Bảng 3.4: Hàm lượng diosgenin trong các loại cao chiết Cát lồi .45

Bảng 3.5: Thời gian xuất hiện giai đoạn động dục đầu tiên ở chuột non .46

Bảng 3.6: Tỉ lệ % các giai đoạn động dục và tỉ lệ động dục (%P + %E) ở nhóm chuột trưởng thành bình thường từ ngày 1 đến ngày 14 .47
Bảng 3.7: Tỷ lệ % động dục dương tính (%P + %E) ở nhóm chuột giảm năng sinh

dục từ ngày 7 đến ngày 15 49

Bảng 3.8: Trọng lượng tử cung-buồng trứng (mg%) ở nhóm chuột non 50

Bảng 3.9: Trọng lượng tử cung-buồng trứng (mg%) ở chuột trưởng thành bình

thường .52

Bảng 3.10: Trọng lượng tử cung (mg%) ở nhóm chuột giảm năng sinh dục .53

Bảng 3.11: Phần trăm kết hợp (B/B0  100) tính được từ các nồng độ chuẩn 54

Bảng 3.12: Nồng độ 17β-estradiol (E2) huyết tương ở nhóm chuột giảm năng sinh

dục .55

Bảng 3.13: Thể trọng trước và sau thử nghiệm ở nhóm chuột non 56

Bảng 3.14: Thể trọng trước và sau thử nghiệm ở chuột trưởng thành bình thường 57

Bảng 3.15: Thể trọng trước và sau thử nghiệm ở nhóm chuột giảm năng sinh dục .58

Bảng 3.16: Đường huyết trước và sau thử nghiệm ở các lô chứng .65

Bảng 3.17: Đường huyết trước và sau thử nghiệm ở các lô GNSD-tiêm STZ .65



DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Costus speciosus Koenig Smith 1

Hình 1.2: Con đường sinh tổng hợp các steroid .6

Hình 1.3: Sự điều hòa hormone thông qua trục H-P-G 7

Hình 1.4: Cơ chế hoạt động ở mức độ phân tử của estrogen 9

Hình 1.5: Hình ảnh mô học tử cung chuột mang thai 4,5 ngày 11

Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của 17β-estradiol, cholesterol, diosgenin và dioscin 21

Hình 2.1: Sơ đồ chiết saponin toàn phần 30

Hình 2.2: Vị trí cắt tử cung để khảo sát trọng lượng (ở chuột giảm năng sinh dục) 36

Hình 3.1: Kết quả sắc ký định tính saponin và sapogenin trong Cát lồi .42

Hình 3.2: Sắc ký đồ chuẩn diosgenin 43

Hình 3.3: Sắc ký đồ cao tổng Cát lồi 44

Hình 3.4: Sắc ký đồ saponin Cát lồi 45

Hình 3.5: Ảnh chụp hiển vi dịch nhờn âm đạo ở các giai đoạn động dục 48

Hình 3.6: Đồ thị đường chuẩn 17β-estradiol 54



ĐẶT VẤN ĐỀ

Estrogen đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như phát triển, sinh sản và chuyển hóa. Estrogen có một phạm vi tác động rộng trên tim mạch, hệ cơ-xương, miễn dịch và hệ thống thần kinh trung ương. Thiếu hụt estrogen ở cả phụ nữ hậu mãn kinh hay những phụ nữ cắt tử cung cũng như buồng trứng đều mang lại nhiều hậu quả khó khắc phục. Thời kỳ đầu mãn kinh gây ra triệu chứng bốc hỏa làm giảm chất lượng sống của người phụ nữ. Hơn nữa, phụ nữ hậu mãn kinh còn đối diện với nhiều nguy cơ bao gồm rối loạn chuyển hóa, xơ vữa động mạch, loãng xương, mất trí nhớ ngắn hạn
Sự can thiệp bằng thuốc, chủ yếu là liệu pháp hormone thay thế - HRT, là một sự lựa chọn ở những phụ nữ mãn kinh vào những năm thập niên 80. Nhưng sau khi những phát hiện từ nghiên cứu của WHI (Women’s Health Initiative Study,
2002) về nguy cơ từ HRT được công bố, việc sử dụng HRT ở Mỹ đã giảm đáng kể. Đa số phụ nữ sau đó đã chuyển sang sử dụng những liệu pháp khác trong đó gồm liệu pháp phytoestrogen-estrogen từ thực vật [13].
Ngoài ra, nhiều nghiên cứu chứng tỏ rằng thiếu estrogen còn liên quan đến hội chứng chuyển hóa (metabolic syndrome), được mô tả là béo phì vùng bụng, kháng isulin và rối loạn lipid, từ đó có nguy cơ dẫn đến các bệnh lý tim mạch và đái tháo đường [16]. Ở những phụ nữ hậu mãn kinh mắc bệnh đái tháo đường type 2, liệu pháp thay thế estrogen cũng như phytoestrogen được sử dụng như một liệu pháp hỗ trợ. Nhiều bằng chứng cho thấy các phytoestrogen có thể đóng vai trò có ích trong béo phì và đái tháo đường. Một vài nghiên cứu gợi ý rằng phytoestrogen, có thể do có cấu trúc tương tự estradiol, có tác động giúp cân bằng glucose, cải thiện sự tiết insulin và sự chuyển hóa lipid [12].
Cát lồi tên khoa học là Costus speciosus Koenig Smith, còn gọi là mía dò, là loài thảo dược được sử dụng nhiều trong y học và thú y. Nghiên cứu của Singh S. và cs. (1972) cho thấy saponin từ thân rễ Cát lồi có tác dụng giống estrogen, làm tăng trọng lượng tử cung và thay đổi sự tăng sinh trong tử cung ở liều 700 mg/kg.



Cát lồi còn là nguồn diosgenin quan trọng. Diosgenin là một sapogenin steroid có cấu trúc tương tự như estradiol và được xem như một phytoestrogen. Tewari P.V. và cs. (1973) báo cáo rằng hoạt động estrogen của 1600 àg diosgenin phân tách từ Cát lồi gần như tương đương với lượng 150 àg neoclinestrol [49]. Ngoài ra, Cát lồi còn thể hiện tác dụng giảm đường huyết tốt trên mô hình đái tháo đường thực nghiệm [22], [23], [24], [38].
Từ các nghiên cứu trên và nhằm mở rộng nguồn phytoestrogen ở Việt Nam chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát một số tác dụng dược lý của các cao chiết và saponin chiết từ thân rễ cây Cát lồi (Costus speciosus)” với các nội dung sau:
- Khảo sát tác dụng estrogen của cao tổng Cát lồi và saponin toàn phần từ Cát lồi trên cơ địa chuột nhắt trắng non, chuột trưởng thành bình thường và chuột bị gây giảm năng sinh dục qua các chỉ tiêu:
 Sự xuất hiện giai đoạn động dục dương tính (estrus phase).

 Sự thay đổi trọng lượng tử cung(-buồng trứng).

 Sự thay đổi hàm lượng 17β-estradiol trong huyết tương.

 Sự thay đổi thể trọng.

- Khảo sát tác dụng hạ đường huyết của cao tổng Cát lồi và saponin toàn phần từ Cát lồi trên mô hình giảm năng sinh dục đi kèm với gây tăng đường huyết bằng streptozotocin.