Thạc Sĩ Khảo sát lên men, thu nhận, tinh chế và dung hợp Grannlocyte colony stimulati factor (G-CSF) tái tổ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh - 2011



MỤC LỤC

TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH iii
LỜI MỞ ĐẦU . 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. NHÂN TỐ KÍCH THÍCH DÕNG BẠCH CẦU HẠT – GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR (G-CSF) . 3
1.1. Giới thiệu chung . 3
1.2. Cấu trúc và hình thái 3
1.3. Nguồn gốc và cơ chế hoạt động . 5
1.3.1. Nguồn gốc 5
1.3.2. Cơ chế hoạt động . 6
1.3.2.1. Sự tương tác của G-CSF với thụ thể . 6
1.3.2.2. Con đường tín hiệu có liên quan . 8
1.4. Hoạt tính sinh học 9
2. PHƯƠNG PHÁP CHỮA BỆNH NEUTROPENIA BẰNG G-CSF . 11
2.1. Bệnh Neutropenia 11
2.2. Chữa bệnh Neutropenia bằng G-CSF 12
2.3. Một số sản phẩm G-CSF thương mại 14
3. SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN G-CSF Ở ESCHERICHIA.COLI . 16
3.1. G-CSF dạng thể vùi điển hình . 16
3.2. G-CSF dạng thể vùi non-classical (thể vùi không điển hình) 18
4. SẢN XUẤT THỂ VÙI KHÔNG ĐIỂN HÌNH . 22
4.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành thể vùi không điển hình G-CSF 22
4.2. Đánh giá thể vùi không điển hình 24

4.2.1. Phân tích phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) 24
4.2.2. Đánh giá khả năng hòa tan trong dung môi gây biến tính nhẹ 25
4.2.3. Xác định đặc tính của thể vùi bằng kính hiển vi điện tử . 25
4.2.4. Xác định xứ thay đổi thể tích thể vùi trong các điều kiện pH . 26
5. DUNG HỢP VÀ TINH CHẾ PROTEIN G-CSF . 27
5.1. Dung hợp protein . 27
5.2. Tinh chế protein . 31
5.2.1. Sắc ký trao đổi ion . 31
5.2.2. Sắc ký lọc gel . 34
5.2.3. Đánh giá hiệu quả của quá trình tinh chế . 35

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

1. VẬT LIỆU . 36
1.1. Thiết bị - dụng cụ . 36
1.2. Hóa chất . 37
1.2.1. Hóa chất dùng cho nuôi cấy vi sinh . 37
1.2.2. Hóa chất dùng để phá tế bào 37
1.2.3. Hóa chất dùng cho điện di SDS-PAGE . 38
1.2.4. Hóa chất dùng trong điện di NATIVE-PAGE . 39
1.2.5. Hóa chất nhuộm bạc . 39
1.2.6. Hóa chất lai Western 39
1.2.7. Hóa chất dùng cho định lượng protein bằng phương pháp Bradford 40
1.2.8. Hóa chất tinh chế bằng sắc ký trao đổi anion 40
1.2.9. Hóa chất thử nghiệm hoạt tính G-CSF 40
1.2.10.Hóa chất dùng trong sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-HPLC) 40
1.2.11.Hóa chất dùng trong dung hợp protein 40
1.2.12.Hóa chất dùng trong phân tích phổ khối (mass spectrometry) 41
1.3. Môi trường . 41
1.4. Nguyên vật liệu 42
1.4.1. Chủng vi sinh vật . 42

1.4.2. Dòng tế bào M-NFS60 . 43
1.4.3. Các thang phân tử lượng dùng trong điện di và chuyển màng 43
1.4.4. Các kháng thể sử dụng cho phương pháp lai Western . 43
1.4.5. Cột tinh chế 44

2. PHƯƠNG PHÁP 44

2.1. Cảm ứng biểu hiện hG-CSF dạng thể vùi không điển hình và khảo sát khả
năng thu nhận hG-CSF có hoạt tính từ thể vùi không điển hình 44
2.1.1. Các bước chuẩn bị 44
2.1.2. Lên men cảm ứng biểu hiện hG-CSF dạng thể vùi không điển hình và không điển hình . 46
2.1.3. Các phương pháp phân tích thể vùi thu được sau quá trình lên men . 46
2.1.3.1. Phương pháp phá tế bào thu nhận thể vùi điển hình và không
điển hình . 48
2.1.3.2. Phương pháp hòa tan thể vùi 48
2.1.3.3. Kiểm tra khả năng biểu hiện hG-CSF bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE 49
2.1.3.4. Xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford . 51
2.1.3.5. Xác nhận cấu hình tự nhiên của hG-CSF bằng kỹ thuật điện di
NATIVE-PAGE và sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-HPLC) . 52
2.1.3.6. Đánh giá hoạt tính sinh học của hG-CSF bằng phương pháp
thử hoạt tính trên tế bào invitro . 55
2.1.3.7. Đánh giá hiệu quả lên men thu nhận hG-CSF 57
2.2. Khảo sát khả năng hòa tan thể vùi không điển hình bằng N-lauroylsarcosine, Tween20 và DMSO 57
2.2.1. Đánh giá mức độ biểu hiện G-CSF bằng phần mềm Quantity One 58
2.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình dung hợp G-CSF với chất cao
phân tử Polyethyleneglycol (PEG) được xúc tác bởi transglutaminase (TGase) . 58

2.3.2. Khảo sát dung dịch đệm và nồng độ TGase trong phản ứng dung hợp
PEG vào G-CSF 59
2.3.3. Khảo sát nhiệt độ phản ứng dung hợp . 59
2.4. Tinh sạch protein sau dung hợp bằng sắc ký trao đổi anion và sắc ký lọc gel 61
2.5. Xác định trọng lượng phân tử của protein dung hợp bằng MALDI-TOF
(Matrix-assisted laser desorption/ionization-Time Of Flight) 64

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
1. CẢM ỨNG BIỂU HIỆN hG-CSF DẠNG THỂ VÙI KHÔNG ĐIỂN HÌNH VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THU NHẬN hG-CSF CÓ HOẠT TÍNH TỪ
THỂ VÙI KHÔNG ĐIỂN HÌNH 66
1.1. Phân tích sự biểu hiện G-CSF dạng thể vùi không điển hình bằng SDS-
PAGE và lai Western 66
1.2. Thu nhận G-CSF có hoạt tính từ thể vùi không điển hình . 67
1.2.1. Hòa tan thể vùi trong N-lauroylsarcosine 67
1.2.2. Phân tích cấu hình tự nhiên của G-CSF thu nhận được bằng NATIVE- PAGE và RP-HPLC 69
1.2.3. Đánh giá hoạt tính sinh học . 72

2. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG HÕA TAN THỂ VÙI KHÔNG ĐIỂN HÌNH
BẰNG N-LAUROYLSARCOSINE, TWEEN20 VÀ DMSO . 73
2.1. Khảo sát khả năng hòa tan . 73
2.2. Khảo sát nồng độ dung dịch hòa tan Tween20 76
2.3. Khảo sát tỉ lệ hòa tan của Tween20 đối với thể vùi không điển hình 76
3. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH DUNG HỢP
PROTEIN G-CSF VỚI PEG ĐƯỢC XÖC TÁC BỞI TGase 78
3.1. Khảo sát thời gian phản ứng dung hợp 78
3.2. Khảo dung dịch đệm và nồng độ TGase trong phản ứng dung hợp PEG vào
G-CSF . 79

4. TINH SẠCH PROTEIN SAU QUÁ TRÌNH DUNG HỢP BẰNG SẮC KÝ
TRAO ĐỔI ANION VÀ SẮC LÝ LỌC GEL 82
4.1. Sắc ký trao đổi anion 83
4.2. Sắc ký lọc gel . 84
5. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA PROTEIN SAU DUNG
HỢP BẰNG MALDI-TOF 86


CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ

1. KẾT LUẬN 89
2. ĐỀ NGHỊ 90

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 91
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 92
PHỤ LỤC . . 96



DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. So sánh ưu nhược điểm của mỗi phương pháp sản xuất protein ở E.coli . 16
Bảng 1.2. So sánh ưu điểm và nhược điểm giữa việc sản xuất protein tái tổ hợp ở
dạng thể vùi điển hình và thể vùi không điển hình 21
Bảng 2.1. Môi trường lên men chủng E. coli BL21(DE3)/pET-G-CSF (TV) 42
Bảng 2.2. Thí nghiệm đo Bradford với dung dịch chuẩn Albumin . 51
Bảng 2.3. Chương trình chạy RP-HPLC phân tích mẫu hG-CSF . 55
Bảng 3.1. So sánh kết quả hòa tan giữa thể vùi không điển hình và điển hình . 68
Bảng 3.2. Hoạt tính của protein trong dịch hòa tan thể vùi điển hình và không điển
hình . 77
Bảng 3.3. Hiệu suất tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion và lọc gel 85


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc gen g-csf, mRNA và protein G-CSF . 4
Hình 1.2. Cấu trúc mô hình bó xoắn 4 chuỗi của G-CSF 5
Hình 1.3. Sự điều hòa sản xuất G-CSF . 6
Hình 1.4. Cấu trúc thụ thể G-CSF . 7
Hình 1.5. Cấu trúc phức hợp tương tác giữa G-CSF và G-CSFR . 8
Hình 1.6. Con đường tín hiệu trong tế bào khi G-CSF gắn với G-CSFR . 9
Hình 1.7. Sự hoạt động và biệt hóa tế bào máu do G-CSF và các cytokine khác . 11
Hình 1.8. Một số sản phẩm hG-CSF thương mại 14
Hình 1.9. Mô hình hấp dẫn giải thích sự hình thành của thể vùi 18
Hình 1.10. Các công đoạn chính của quá trình thu nhận G-CSF từ thể vùi điển hình
và không điển hình sau quá trình sản xuất ở E. coli 20

Hình 1.11. Phổ hồng ngoại (IR) ở các vùng Amit I và Amit II của G-CSF ở dạng
dung dịch, dạng tủa và dạng thể vùi . 24
Hình 1.12. Ảnh cắt dọc của tế bào E. coli dưới kính hiển vi điện tử truyền suốt . 26
Hình 1.13. Thể vùi không điển hình của G-CSF dưới kính hiển vi điện tử quét 26
Hình 1.14. Sự giảm thể tích cặn thể vùi khi thay đổi pH môi trường từ 7 xuống 4 27
Hình 1.15. Quá trình dung hợp PEG với phân tử G-CSF tại đầu N-terminal 29
Hình 1.16. Quá trình dung hợp PEG với phân tử G-CSF tại nhóm acyl thuộc
Glutamine tại vị trí 133 trên phân tử GCSF 31
Hình 1.17. Nguyên tắc sắc kí trao đổi anion . 33
Hình 1.18. Nguyên tắc sắc kí trao đổi cation . 33
Hình 1.19. Nguyên tắc sắc kí lọc gel . 34
Hình 2.1. Các vị trí lắp đặt thiết bị trên bình lên men . 45
Hình 2.2. Hệ thống thiết bị lên men 46
Hình 2.3. Sơ đồ các bước đánh giá khả năng thu nhận G-CSF từ hai dạng thể vùi
điển hình và không điển hình . 47
Hình 2.4. Phương pháp điện di SDS-PAGE 50
Hình 2.5. Phản ứng cho màu Coomassie . 51
Hình 2.6. Đồ thị miêu tả đường chuẩn Bradford . 52
Hình 2.7. Sơ đồ đánh giá lượng G-CSF qua các bước xử lý sau lên men . 57
Hình 3.1. Xác nhận sự biểu hiện protein G-CSF ở dạng thể vùi không điển hình
bằng điện di SDS PAGE và lai Western 66
Hình 3.2. Khả năng hòa tan của protein nằm trong thể vùi điển hình và thể vùi
không điển hình 68
Hình 3.3. So sánh khả năng hòa tan giữa thể vùi điển hình và không điển hình 69
Hình 3.4. So sánh cấu hình tự nhiên của G-CSF so với mẫu neupogen chuẩn bằng
điện di NATIVE PAGE . 70
Hình 3.5. Kiểm tra cấu hình tự nhiên của protein nằm trong dịch hòa tan bằng RP- HPLC 71

Hình 3.6. Lượng G-CSF có hoạt tính trong dịch hòa tan từ thể vùi điển hình và thể
vùi không điển hình 72
Hình 3.7A. Định tính khả năng hòa tan thể vùi không điển hình bằng
N-lauroylsarcosine, DMSO và Tween20 . 74
Hình 3.7B. Lượng G-CSF trên 1g thể vùi không điển hình 75
Hình 3.8. Lượng G-CSF hòa tan được tính trên 10mg thể vùi không điển hình với tỉ
lệ hòa tan 1g thể vùi : 40ml dung dịch hòa tan 76
Hình 3.9. Đồ thị biểu thị lượng G-CSF sau hòa tan tính trên 10mg thể vùi không
điển hình với các tỉ lệ hòa tan khác nhau . 77
Hình 3.10. Kết quả dung hợp G-CSF với PEG5kDa ở các khoảng thời gian khác
nhau 78
Hình 3.11. Kết quả dung hợp PEG5kDa với G-CSF ở hai hệ đệm nước miliQ và
phosphate buffer . 80
Hình 3.12. Kết quả khảo sát nhiệt độ tối ưu cho enzyme TGase hoạt động . 81
Hình 3.13. Kết quả tinh sạch sản phẩm sau dung hợp bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion . 83
Hình 3.14. Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh chế bằng phương pháp sắc
ký lọc gel 85
Hình 3.15. Kết quả phân tích phổ khối sản phẩm sau dung hợp bằng MALDI-TOF . 87




LỜI MỞ ĐẦU


Ung thư là căn bệnh có nguy cơ toàn cầu vì mức độ lan rộng cũng như tỉ lệ gia tăng số người mắc bệnh ngày càng cao. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) số người tử vong vì ung thư vào năm 2008 là 7,6 triệu, chiếm 13% trong tổng số ca tử vong. Ở Việt Nam, ung thư là một vấn đề được toàn xã hội quan tâm vì mức độ gia tăng nhanh chóng cũng như nhiều hạn chế trong điều trị.Với chức năng kích thích sự biệt hóa, tăng sinh, trưởng thành và chức năng của các tế bào bạch cầu trung tính trong vùng máu ngoại vi chống lại sự nhiễm khuẩn và các rủi ro khác khi điều trị ung thư, G-CSF đã được quan tâm sản xuất trong nhiều hệ thống biểu hiện khác nhau như vi khuẩn, nấm men, tế bào động vật . Trong đó, G-CSF tái tổ hợp đươc biểu hiện trong hệ thống vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) được sử dụng rộng rãi do có ưu điểm nuôi cấy đơn giản, chi phí sản xuất thấp, và năng suất cao, tuy nhiên, protein thu nhận được thường ở dạng thể vùi, và không có hoạt tính sinh học.
Gần đây, Spela Petenel và cộng sự đã khám phá ra một dạng mới của thể vùi khi biểu hiện vượt mức trong tế bào E.coli, bên trong lớp thể vùi có cấu trúc gấp cuộn sai là các tiền chất gấp cuộn đúng, dễ dàng hoà tan trong dung dịch chất biến tính nhẹ, và đặc biệt là có hoạt tính sinh học sau khi hoà tan, được nhóm tác giả này gọi là thể vùi không điển hình (non classical inclusion body).
Năm 1991, sản phẩm G-CSF tái tổ hợp đầu tiên được thương mại hóa có tên Neupogen, do công ty Amgen - Hoa Kỳ sản xuất, với giá thành một lọ tiêm 300µg/ml khoảng 1,7 triệu đồng. Do mức độ đào thải Neupogen ra khỏi cơ thể bởi các protease cũng như là khả năng gây đáp ứng miễn dịch trong tế bào khá cao, nên người bệnh cần phải được tiêm nhắc mỗi ngày trong suốt quá trình điều trị ung thư. Một lần nữa công ty Amgen đã đi đầu trong nghiên cứu khắc phục nhược điểm của Neupogen bằng cách tiến hành dung hợp G-CSF với chất cao phân tử Polyethylenglycol (PEG) và đã dung hợp thành công G-CSF với NH2-PEG20kDa tại vị trí đầu N của protein, Năm 2002, cơ quan quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa kỳ đã phê duyệt và đồng ý cho sản phẩm dung hợp này, có tên thương mại là Neulasta, được sử dụng thay thế cho các protein G-CSF tái tổ hợp đơn thuần, giúp cho quá trình điều trị ung thư dễ dàng và chi phí cũng thấp hơn.
Việc nhập khẩu các sản phẩm G-CSF cũng như PEG-G-CSF từ nước ngoài để điều trị cho các bệnh nhân đã làm cho chi phí điều trị tăng lên khá cao và không phù hợp với phổ rộng người bệnh nước ta. Do đó, việc nghiên cứu các qui trình công nghệ để sản xuất protein G-CSF tái tổ hợp dung hợp với chất cao phân tử PEG nhằm đáp ứng nhu cầu trong nước, giúp giảm chi phí điều trị, phù hợp với thu nhập của đại bộ phận bệnh nhân nước ta là một yêu cầu cấp thiết.
Với mục tiêu như trên, chúng tôi thực hiện đề tài thạc sỹ: “Khảo sát lên men, thua nhận, tinh chế và dung hợp Grannlocyte colony stimulati factor (G-CSF) tái tổ hợp từ E. coli với Polyethylenglycol (PEG)” với các nội dung chính như sau:
– Cảm ứng biểu hiện hG-CSF dạng thể vùi không điển hình
– Khảo sát khả năng thu nhận hG-CSF có hoạt tính từ thể vùi không điển hình
– Khảo sát khả năng hoà tan thể vùi không điển hình bằng N-lauroylsarcosine, Tween20 và DMSO
– Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình dung hợp hG-CSF với chất cao phân tử Polyethyleneglycol (PEG) bằng enzyme transglutaminase (TGase)
– Tinh sạch protein sau quá trình dung hợp
– Phân tích trọng lượng phân tử của protein dung hợp sau tinh chế bằng phương pháp phổ khối (mass spectrometry)