Luận Văn Khảo sát khả năng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù cây Drosera burmanni Vahl tro

MỤC LỤC


CHưƠNG TRANG

Trang tưa ị

Lơi cam ơn .iiì ̉

T́m tắt .iv

Summary .v

Ṃc luc .vị

Danh sach cac chư viế t tắ t ix́ ́ ̃

Danh sach cac hinh . x́ ́ ̀

Danh sach cac sơ đồ và biểu đồ xií ́

Danh sach cac bang xiií ́ ̉


Chương1: MỞ ĐẦU 1

1.1. Đặt vấn đề . 1

1.2. Ṃc tiêu 2

1.3. Yêu cầu 2

1.4. Ý nghĩa đề tài 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. Tổng quan về Drosera burmanni Vahl 3

2.1.1. Ṿ trí phân lọi 3

2.1.2. Phân bố . 3

2.1.3. Mô tả hình th́i . 4

2.1.4. Đặc tính sinh học 6

2.1.5. Đặc điểm sinh th́i 7

2.1.6. Thành phần h́a học . 8

2.1.7. Phương ph́p nhân giống 11

2.1.8. Tầm quan trọng 12

2.1.8.1. Ý nghĩa về sinh th́i 12

2.1.8.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến h́a thực vật . 12

2.1.8.3. Gía tṛ dược tính . 12

2.1.8.4. Ứng ḍng trong công nghiệp 14

2.1.8.5. Gía tṛ kinh tế 15

2.1.9. Ćc nghiên cứu trong và ngoài nước 16

2.2. Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy huyền ph̀ tế bào để thu nhận

hợp chất thứ cấp 17

2.2.1. Kh́i niệm hợp chất thứ cấp . 17

2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo . 18

2.2.2.1. Kh́i niệm mô sẹo . 18

2.2.2.2. Ứng ḍng c̉a nuôi cấy mô sẹo 19

2.2.3. Nuôi cấy ḍch huyền ph̀ 19

2.2.3.1. Kh́i niệm huyền ph̀ tế bào . 19

2.2.3.2. Nguyên tắc ṭo huyền ph̀ 19


2.2.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự ṭo huyền ph̀ tế bào . 20

2.2.3.4. Ćc phương ph́p nuôi cấy huyền ph̀ hiện nay . 20

2.2.3.5. Ćc điều kiện nuôi cấy ḍch tế bào ảnh hưởng đến việc sản xuất

ćc hợp chất thứ cấp 22

2.2.4. Ćc phương ph́p gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi

cấy huyền ph̀ . 22

2.2.4.1. Tối ưu h́a điều kiện nuôi cấy . 22

2.2.4.2. Chọn lọc dòng tế bào ć khả năng sản xuất cao . 22

2.2.4.3. Bổ sung tiền chất . 22

2.2.4.4. Cố đ̣nh tế bào . 23

2.2.4.5. Cảm ứng sự phân h́a mô 23

2.2.4.6. Nhân tố cảm ứng (elicitor) 23

2.3. Ćc kỹ thuật sử ḍng trong bài luận văn 24

2.3.1. Phương ph́p ly trích – thu nhận hợp chất 24

2.3.1.1. Sắc ký cột 24

2.3.1.2. Sắc ký nhanh cột khô (Dry Column Flash Chromatography) . 26

2.3.1.3. Sắc ký lớp mỏng điều chế . 27

2.3.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao ́p HPLC trong đ̣nh lượng hợp chất thứ cấp . 28

Chương 3: VẬT LIỆU – PHưƠNG PHÁP 31

Thời gian và đ̣a điểm thực hiện 31

3.1. Nuôi cấy mô sẹo, ṭo ḍch huyền ph̀ . 31

3.1.1. Vật liệu 31

3.1.2. Phương ph́p 33

3.1.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo śt ảnh hưởng c̉a thành phần khóng và

nồng độ đường lên sự ph́t triển c̉a mẫu cấy lớp mỏng 33

3.1.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo śt sự kết hợp 2 lọi hormone thích hợp cho

việc kích ứng ṭo mô sẹo . 34

3.1.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo śt nồng độ thích hơp c̉a 2,4-D khi kết hợp ̣

với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng ṭo mô sẹo . 35

3.1.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo śt ảnh hưởng c̉a ćc kiểu nuôi cấy lên sự

tăng sinh khối mô sẹo và ṭo ḍch huyền ph̀ . 36

3.1.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo śt sự ảnh hưởng c̉a ́nh śng lên sự

hình thành sắc tố đỏ c̉a mô sẹo 37

3.2. Ly trich va cô lâp hơp chấ t anthraquinone trong cây D. burmanni 38́ ̀ ̣ ̣

3.2.1. Vật liệu 38

3.2.2. Phương ph́p 39

3.3. Đ̣nh lượng hợp chất anthraquinone trong ćc nguyên liệu

nuôi cấy in vitro kh́c nhau bằng phương ph́p sắc ký lỏng cao ́p HPLC 40

3.3.1. Vật liệu 40

3.3.2. Phương ph́p . 40

3.3.2.1. X́c đ̣nh điều kiện, thông số kỹ thuật thích hợp . 40

3.3.2.2. Xây dựng đường chuẩn . 41


3.3.2.3. Thí nghiệm 6: Khảo śt ảnh hưởng c̉a ćch xử lý mẫu trong

đ̣nh lượng hợp chất anthraquinone . 41

3.3.2.4. Thí nghiệm 7: So śnh hàm lượng hợp chất anthraquinone trong

ćc bộ phận kh́c nhau c̉a cây in vitro 43

3.3.2.5. Thí nghiệm 8: So śnh hàm lượng hợp chất anthraquinone trong

ćc mẫu cây ć sắc tố đỏ và mẫu không ć sắc tố đỏ . 44

3.3.2.6. Thí nghiệm 9. X́c đ̣nh hàm lượng anthraquinone trong mẫu

ḍch huyền ph̀ đã ṭo được từ thí nghiệm 4 45

3.4. Xử lý thống kê . 45

Chương 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 46

4.1. Nuôi cấy mô sẹo ṭo ḍch huyền ph̀ . 46

4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo śt ảnh hưởng c̉a thành phần khóng và

nồng độ đường lên sự ph́t triển c̉a mẫu cấy lớp mỏng 46

4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo śt sự kết hợp 2 lọi hormone thích hợp cho

việc kích ứng ṭo mô sẹo . 48

4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo śt nồng độ thích hơp c̉a 2,4-D khi kết hợp ̣

với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng ṭo mô sẹo . 49

4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo śt ảnh hưởng c̉a ćc kiểu nuôi cấy lên sự

tăng sinh khối mô sẹo và ṭo ḍch huyền ph̀ . 54

4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo śt sự ảnh hưởng c̉a ́nh śng lên sự

hình thành sắc tố đỏ c̉a mô sẹo 56

4.2. Ly trich va cô lâp hơp chấ t anthraquinone trong cây D. burmanni 58́ ̀ ̣ ̣

4.3. Đ̣nh lượng hợp chất anthraquinne trong ćc nguyên liệu nuôi cấy

in vitro kh́c nhau bằng phương ph́p sắc ký lỏng cao ́p HPLC . 59

4.3.1. Xây dựng đường chuẩn . 59

4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo śt ảnh hưởng c̉a ćch xử lý mẫu trong đ̣nh

lương hợp chất anthraquinone . 61̣

4.3.3. Thí nghiệm 7: So śnh hàm lượng hợp chất anthraquinone trong

ćc bộ phận kh́c nhau c̉a cây in vitro 62

4.3.4. Thí nghiệm 8: So śnh hàm lượng hợp chất anthraquinone trong

ćc mẫu ć sắc tố đỏ và mẫu không ć sắc tố đỏ 64

4.3.5. Thí nghiệm 9. X́c đ̣nh hàm lượng anthraquinnone trong mẫu

ḍch huyền ph̀ đã ṭo được từ thí nghiệm 4 . 66

Chương 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ . 68

5.1. Kết luận . 68

5.1.1. Nuôi cấy mô sẹo ṭo ḍch huyền ph̀ 68

5.1.2. Đ̣nh lượng hợp chất anthraquinone bằng sắc ký lỏng cao ́p HPLC . 68

5.2. Đề ngḥ 69


TÀI LIỆU THAM KHẢO . 70

PHỤ LỤC


DANH SACH CÁC H̀NH́


TRANG


Hình 2.1. Khu vực phân bố c̉a Drosera burmanni Vahl trên thế giới 4


Hình 2.2. Hình th́i c̉a Drosera burmanni Vahl 4


Hình 2.3. Ĺ D. burmanni 5


Hình 2.4. D. burmanni Vahl ngoài tự nhiên. . 7


Hình 2.5. Cấu tŕc h́a học c̉a một số flavonoid và flavonoid glucoside 10


Hình 2.6. Môt số loai Drosera ć gí tṛ kinh tế cao trên thế giới . 15̣ ̣


Hình 2.7. Hệ thống nuôi cấy gín đọn qui mô nhỏ trên ćc ḿy lắc . 21


Hình 2.8. Một bioreactor ở qui mô phòng thí nghiệm . 21


Hình 2.9. Sắ c ky côt . 24́ ̣


Hình 2.10. Mô hinh sắ c ky nhanh côt khô . 26̀ ́ ̣


Hình 2.11. Sắc ký lớp mỏng . 27


Hình 2.12. Sơ đồ hoat đông cac bô phân cua may HPLC 29̣ ̣ ́ ̣ ̣ ̉ ́


Hình 3.1. Cây D. burmanni Vahl nuôi cấy in vitro 31


̃

Hình 4.1. Mô seo đươc hinh thanh tư mâu lơp mong cây D.burmanni trên ̣ ̣ ̀ ̀ ̀ ́ ̉


̉

môi trương Gamborg’s B5 bô sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D vơi ̀ ́


nồ ng đô thay đôi . 52̉

̣


̃

Hình 4.2. Mô seo đươc hinh thanh tư mâu lơp mong long thân cây ̣ ̣ ̀ ̀ ̀ ́ ̉ ́


̉

D. burmanni trên môi trương Gamborg’s B5 bô sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D̀


vơi nồ ng đô thay đôi . 53̉

̣

́


Hình 4.3.A. Mô sẹo nuôi trong môi trường lỏng lắc 55


Hình 4.3.B. C̣m tế bào quan dưới kính hiển vi 40X. . 55


Hình 4.3.C. Tế bào đơn quan dưới kính hiển vi 40X 55


Hình 4.4. ̉nh hưởng c̉a ́nh śng lên sự hình thành sắc tố đỏ c̉a


mô seo cây D. burmanni 57̣


Hình 4.5. Sắc ký đồ HPLC c̉a anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm . 60


Hình 4.6. Sắc ký đồ HPLC c̉a anthraquinone tham chiếu ở 28 ppm . 60

Hình 4.7. Sắc ký đồ HPLC c̉a anthraquinone tham chiếu ở 42 ppm . 60


Hình 4.8. Sắc ký đồ HPLC c̉a anthraquinone tham chiếu ở 56 ppm . 60


Hình 4.9. Sắc ký đồ HPLC c̉a anthraquinone tham chiếu ở ơ 70 ppm 60̉


Hình 4.10. Sắc ký đồ HPLC c̉a mẫu cây D. burmanni được xử lý theo


quy trình A. 61


Hình 4.11. Sắc ký đồ HPLC c̉a mẫu cây D. burmanni được xử lý theo


quy trình B 61


Hình 4.12. Sắc ký đồ HPLC c̉a mẫu rễ cây D. burmanni Vahl . 63


Hình 4.13. Sắc ký đồ HPLC c̉a mẫu thân la cây D. burmanni Vahl 63́


Hình 4.14. Sắc ký đồ HPLC c̉a mẫu cây D. burmanni Vahl ć sắc tố đỏ. 65


Hình 4.15. Sắc ký đồ HPLC c̉a mẫu cây D. burmanni Vahl không


ć sắc tố đỏ . 65


Hình 4.16. Sắc ký đồ HPLC c̉a mẫu ḍch môi trường sau khi lọc


sinh khối tế bào 66


Hình 4.17. Sắc ký đồ HPLC c̉a sinh khối tế bào từ ḍch huyền ph̀ 66