ĐẶT VẤN ĐỀ Herpes simplex virus (HSV) là tác nhân gây bệnh rất thường gặp, gây các bệnh khác nhau từ nhẹ đến nặng, và trong một số trường hợp chúng có thể gây tử vong, đặc biệt ở bệnh nhân tổn thương miễn dịch. Sau nhiễm trùng ban đầu, HSV sẽ tồn tại trong ký chủ suốt toàn bộ thời gian sống sau đó. Các đồng đẳng nucleosid như acyclovir (AC), penciclovir vv là các thuốc duy nhất được chính thức phê chuẩn cho điều trị nhiễm HSV. Các thuốc này thường có hiệu quả trong điều trị nhiễm HSV ban đầu hoặc là tái nhiễm. Tuy nhiên việc sử dụng tràn lan các thuốc nucleosid đã làm nảy sinh các chủng HSV đề kháng với các thuốc tương đồng, đặc biệt là ở các bệnh nhân tổn thương miễn dịch. Theo các điều tra trước đây, sự mắc phải chủng đề kháng AC ở các bệnh nhân tổn thương miễn dịch là khoảng 5% và ở các bệnh nhân cấy ghép tủy xương là 14% [42]. Sự phổ biến cao của HSV đề kháng ACV trong các dân số này cho thấy là cần phải có thuốc mới. Đồng thời, HSV cũng chiếm tỷ lệ khá cao (20-40%), một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh cơ hội của những người bị nhiễm HIV. Sự nhiễm HSV ở bệnh nhân HIV/AIDS thường diễn biến dai dẳng và hay tái phát và càng làm tăng nguy cơ đề kháng thuốc. Nhiều quốc gia có chương trình tìm kiếm thuốc mới từ nguồn gốc tự nhiên có tác dụng kháng virus trong đó có herpes simplex týp 1 và týp 2; Một số công trình nghiên cứu đơn lẻ trong vòng 20 năm trở lại đây cho thấy một số loài thảo mộc và các hợp chất phân lập được có nhiều tiềm năng bổ sung hoặc thay thế trong trường hợp có sự đề kháng với nhóm thuốc acyclovir [18], [20], [36], [43]. Có 79 loài thảo mộc được đánh giá có tác dụng khả quan trên HSV-1 và 2, trong đó 42 cây thuốc có ở Việt Nam. Trong những nghiên cứu sâu hơn về nhóm hoạt chất tự nhiên có tác dụng trên HSV týp 1 và 2 khá đa dạng trong đó có nhóm diterpen lacton từ Xuyên tâm liên. Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees) là dược liệu được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và sử dụng, được dùng rộng rãi ở các nước châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Malaysia, Pakistan, để chữa các bệnh liên quan đến đường hô hấp và tiêu hóa, giảm đau, hạ sốt, [13], [19], [23], [28], [34], [45], [49], [50], [51], [55], [59], [60], [62], [64], [67]. Ở Việt Nam, Xuyên tâm liên cũng được sử dụng phổ biến vào thời kì chiến tranh như là một thuốc kháng sinh khi thuốc kháng sinh còn khan hiếm. Hợp chất diterpen lacton có trong Xuyên tâm liên hiện nay được chứng minh là có rất nhiều tác dụng chữa bệnh, như là: kháng viêm, giảm đau, hạ huyết áp, bảo vệ gan, ngừa tiểu đường, kháng virus và chống ung thư, nhiều chế phẩm chứa hoạt chất từ Xuyên tâm liên đã được sản xuất nhằm phục vụ cho người bệnh. Tuy nhiên nghiên cứu về khả năng kháng HSV của Xuyên tâm liên chưa nhiều, đơn cử có công bố ngắn của C.Wiart và cs trên Phytotherapy research về khả năng ức chế HSV1 của các diterpen từ Xuyên tâm liên. Đề tài: “Khảo sát khả năng ức chế virus herpes simplex của diterpen lacton từ Xuyên tâm liên” nhằm nghiên cứu sâu hơn về khả năng kháng HSV của các diterpen lacton để định hướng khả năng sử dụng Xuyên tâm liên như một loại dược liệu chữa trị cho bệnh nhân nhiễm HSV. Nội dung thực hiện của đề tài: o Phân lập và xác định cấu trúc của các diterpen lacton chính trong Xuyên tâm liên. o Định lượng các diterpen lacton chính trong nguyên liệu và cao loại màu. o Xác định hoạt tính kháng virus herpes simplex týp 1 và 2 của cao loại màu và các diterpen lacton tinh sạch. MỤC LỤC 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY XUYÊN TÂM LIÊN 3 1.1.1 Mô tả thực vật 3 1.1.2 Phân bố 4 1.1.3 Sinh thái, trồng trọt và thu hoạch .4 1.1.4 Thành phần hóa học .5 1.1.5 Tác dụng dược lý .7 1.1.6 Một số nghiên cứu về chiết xuất và định lượng diterpen lacton trong Xuyên tâm liên trong nước và trên thế giới .9 1.2 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO .11 1.2.1 Định nghĩa 11 1.2.2 Ứng dụng của HPLC trong định tính dược liệu .11 1.2.3 Chất đối chiếu 12 1.2.4 Thẩm định quy trình phân tích .13 1.3 GIỚI THIỆU HERPES SIMPLEX VIRUS 16 1.3.1 Phân loại 16 1.3.2 Đặc điểm-hình thái-cấu tạo 16 1.3.3 Sự sinh sôi của HSV-2 .18 1.3.4 Quá trình phiên mã và biểu hiện gen .20 1.3.5 Sự biểu hiện bệnh 21 1.3.6 Chẩn đoán Herpes simplex virus .21 1.3.7 Phòng bệnh và điều trị .23 1.3.8 Phương pháp nghiên cứu tác nhân có tác dụng kháng HSV .24 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .28 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 28 2.1.1 Dược liệu 28 2.1.2 Vật liệu sinh học 28 2.2 HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY .28 2.2.1 Hóa chất chiết xuất và kiểm tra dược liệu .28 2.2.2 Hóa chất thử hoạt tính kháng virus 29 2.3 DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ .30 2.3.1 Dụng cụ thiết bị trong chiết xuất dược liệu .30 2.3.2 Thiết bị phân tích .31 2.3.3 Dụng cụ thiết bị thực hiện phản ứng sinh học .31 2.4 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC DITERPEN LACTON TỪ XUYÊN TÂM LIÊN 32 2.4.1 Chiết xuất diterpen toàn phần từ Xuyên tâm liên 32 2.4.2 Phân lập 3 diterpen lacton chính từ cao chiết Xuyên tâm liên 33 2.4.3 Xác định lý hóa tính, các phổ nghiệm của 3 diterpen lacton phân lập được 34 2.5 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 3 DITERPEN LACTON BẰNG HPLC .34 2.5.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống 35 2.5.2 Thẩm định quy trình định lượng 35 2.5.3 Xử lý thống kê .36 2.5.4 Áp dụng quy trình đã xây dựng để định lượng diterpen lacton trong dược liệu ban đầu và mẫu cao loại màu của Xuyên tâm liên .36 2.6 QUY TRÌNH THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VIRUS HERPES SIMPLEX (HSV) CỦA CAO CHIẾT XUYÊN TÂM LIÊN VÀ 3 DITERPEN LACTON 37 2.6.1 Nuôi cấy tế bào 37 2.6.2 Phương pháp đếm tế bào 38 2.6.3 Tạo nguồn HSV chuẩn .39 2.6.4 Xác định TCID50 của hỗn dịch virus .39 2.6.5 Chuẩn bị dịch thử .41 2.6.6 Phương pháp nhuộm tế bào bằng xanh methylen 41 2.6.7 Phương pháp thử nghiệm độc tính tế bào (Cytotoxicity assay) .42 2.6.8 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng virus (Antivirus assay) .43 2.6.9 Tính chỉ số chọn lọc SI (hệ số trị liệu SI) 44 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37 3.1 CHIẾT XUẤT DITERPEN LACTON TOÀN PHẦN TỬ LÁ XUYÊN TÂM LIÊN 45 3.2 PHÂN LẬP 3 DITERPEN LACTON CHÍNH TỪ CAO CHIẾT XTL 46 3.2.1 Phân lập A1 46 3.2.2 Phân lập A2 và A3 48 3.3 XÁC ĐỊNH LÝ HÓA TÍNH VÀ CÁC PHỔ NGHIỆM CỦA 3 DITERPEN LACTON PHÂN LẬP ĐƯỢC .49 3.3.1 Cảm quan .49 3.3.2 Phản ứng hóa học .50 3.3.3 Điểm nóng chảy .50 3.3.4 Sắc ký lớp mỏng 51 3.3.5 Sắc ký lỏng hiệu năng cao .52 3.3.6 Phổ tử ngoại .55 3.3.7 Phổ hồng ngoại .56 3.3.8 Phổ khối (MS) 57 3.3.9 Phổ proton NMR (1H-NMR) .57 3.3.10 Phổ carbon 13 NMR (13C-NMR) .58 3.4 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG .60 3.4.1 Thăm dò điều kiện tách 3 diterpen lacton trên HPLC .60 3.4.2 Xây dựng quy trình định lượng .61 3.4.3 Khảo sát tính tương thích hệ thống 63 3.4.4 Thẩm định quy trình định lượng 66 3.4.5 Quy trình định lượng andrographolid, dehydroandrographolid và neoandrographolid trong dược liệu Xuyên tâm liên bằng HPLC .72 3.4.6 Áp dụng quy trình đã xây dựng để định lượng 3 diterpen lacton chính trong bột lá Xuyên tâm liên và cao chiết loại màu .73 3.5 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG HSV-1 VÀ HSV-2 CỦA CAO VÀ CÁC CHẤT TINH KHIẾT .74 3.5.1 Xác định hiệu giá virus theo TCID50 .74 3.5.2 Khảo sát độ độc của cao chiết và chất tinh khiết trên tế bào Vero 75 3.5.3 Khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 của cao chiết và chất tinh khiết trên tế bào Vero 80 3.5.4 So sánh khả năng ức chế virus của cao chiết và các chất tinh khiết 89 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 92
