LỜI MỞ ĐẦU Trong hơn hai thập kỷ qua, nuôi trồng thủy sản ở nước ta nói chung và nghề nuôi cá Tra nói riêng phát triển rất nhanh, đã và đang mang lại nhiều lợi ích về mặt kinh tế và xã hội. Tuy nhiên, nuôi trồng thủy sản nước ngọt thiếu quy hoạch đã gây ra những thiệt hại đáng kể về kinh tế và môi trường. Nuôi cá Tra, cá Basa thâm canh cao và việc bơm chất thải trực tiếp ra sông đã làm cho nguồn nước sông bị ô nhiễm. Qua khảo sát lượng chất thải lỏng cho thấy: Nước thải, bùn thải trong và sau nuôi có hàm lượng cao các thông số (như: TSS, BOD5 , COD, Nitơ tổng số, Phospho tổng số; và các chỉ tiêu khác như: NO3 - , NH4 , P – PO3 , H2S; Thức ăn thừa bị dịch hóa; Thuốc, hóa chất, chế phẩm xử lý ao đầm và phòng trị bệnh; Các mùi hôi tanh trong không khí tại các thời điểm trong và sau khi nuôi). N, C, P là những nguyên tố chủ yếu trong chất thải có nguồn gốc từ việc cho dư lượng thức ăn, và nguồn nước không ổn định, thức ăn dễ tan cá không hấp thu được, Chiếm khoảng 30 – 40% sự ô nhiễm. Các hợp chất hữu cơ chứa N, C, P có nhiều trong ao là các chất dinh dưỡng gây nên sự phú dưỡng, kèm theo đó là sự tăng sinh của vi khuẩn, tảo. Sự có mặt của các hợp chất hữu cơ làm giảm lượng oxy hóa tan, làm tăng BOD, COD, H2S, NH3 và hàm lượng khí methan trong khu vực nước tự nhiên. Một số vấn đề khác do nghề nuôi cá tra, Basa gây nên là làm tăng sự lắng tụ bùn ở ao nuôi và các vùng lân cận. Sự tích tụ các chất hữu cơ đến cuối vụ nuôi đã gây ra sự tự ô nhiễm chính trong ao nuôi làm ảnh hưởng ngược đến động vật nuôi do thiếu oxy. Chính vì những tác động trên mà việc tìm giải pháp khắc phục và xử lý nhằm cải thiện chất lượng nước ao nuôi, bảo vệ môi trường nói chung, cũng như phát triển nghề nuôi cá Tra, Basa một cách bền vững là vô cùng cần thiết. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy, các hệ thống xử lý chất thải dạng lơ lửng sử dụng các chế phẩm sinh học có tiềm năng ứng dụng rất cao. Khi đưa các chế phẩm vi sinh vào môi trường nước ao, các vi sinh vật trong chế phẩm sẽ sinh sôi và phát triển rất nhanh trong môi trường nước. Hoạt động của các vi sinh vật này có tác dụng lên môi trường nước ao nuôi cá như: - Phân hủy các chất hữu cơ trong nước, hấp thu xác tảo chết, giảm độ đục và hạn chế sự tạo bùn đáy ao nuôi cá. - Giảm các độc tố trong nước (do các chất khí NH3 , H2S, phát sinh). Do đó làm giảm mùi hôi trong nước ao nuôi và không khí xung quanh ao nuôi. - Giúp ổn định độ pH của nước, ổn định màu nước do vi sinh vật của chế phẩm hấp thu các chất dinh dưỡng hòa tan trong nước, nên hạn chế sự phát triển của tảo, và do đó sẽ giảm chi phí thay nước, giảm tác động lên môi trường xung quanh. Tuy nhiên, nếu đưa một số chủng vi sinh ngoại lai từ các chế phẩm vi sinh vào môi trường nước ao nuôi cá Tra thì sẽ ảnh hưởng đến sinh thái môi trường nước vì khả năng tăng sinh của các chủng này rất lớn. Đây cũng là lý do mà chúng tôi quyết định chọn đề tài “Khảo sát khả năng tổng hợp amylase, protease của những chủng vi khuẩn phân lập từ ao nuôi cá Tra”. Nội dung nghiên cứu của đề tài: Phân lập các chủng vi khuẩn từ nước ao nuôi cá Tra. Khảo sát và chọn lọc ra các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp amylase, protease cao nhất. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp các enzyme trên môi trường nuôi cấy lỏng. Sơ bộ thử nghiệm tác dụng của chủng vi khuẩn đã chọn lên môi trường nước ao nuôi cá Tra. MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các Bảng biểu Danh mục Hình - Biểu đồ - Sơ đồ - Đồ thị LỜI MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1.1 Thực trạng ô nhiễm do nghề nuôi cá Tra trên địa bàn tỉnh Đồng Tháp 1 1.1.1 Khái quát về ngành nuôi trồng thủy sản và nghề nuôi cá Tra 1 1.1.2 Một số tác động tiêu cực lên môi trường do nghề nuôi cá Tra .3 1.2. Một số giải pháp giúp hạn chế và khắc phục tình trạng ô nhiễm 8 1.2.1 Các giải pháp về quản lý .8 1.2.2 Các giải pháp về quy hoạch .9 1.2.3 Các giải pháp về khoa học công nghệ .9 1.2.4 Các giải pháp về kỹ thuật 10 1.3 Khái quát về hệ vi khuẩn trong nước 12 1.3.1 Vi khuẩn trong nước ngọt .12 1.3.2 Một số chuyển hóa vật chất do vi khuẩn dị dưỡng trong nước 13 1.3.2.1 Thủy phân tinh bột 13 1.3.2.2 Chuyển hóa protein .14 1.3.2.3 Ý nghĩa của quá trình amon hóa protein 16 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1. Vật liệu 19 2.1.1 Chủng vi sinh vật 19 2.1.2 Môi trường phân lập, giữ giống và nuôi cấy 19 2.1.2.1. Môi trường phân lập và nuôi cấy .19 2.1.2.2 Môi trường khảo sát amylase ngoại bào .20 2.1.2.3 Môi trường khảo sát protease ngoại bào .21 2.1.2.4 Môi trường nuôi cấy khảo sát hoạt độ amylase .21 2.1.2.5 Môi trường nuôi cấy khảo sát hoạt độ protease 22 2.1.2.6 Môi trường khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng lên hoạt độ amylase .23 2.1.2.7 Môi trường khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng lên hoạt độ protease .24 2.1.2.8 Môi trường nước ao cá Tra .24 2.2 Phương pháp 25 2.2.1 phương pháp phân lập: .25 2.2.1.1 Phương pháp lấy mẫu nước 25 2.2.1.2 Phương pháp phân lập và giữ giống 25 2.2.1.3 Phương pháp nhuộm Gram .25 2.2.1.4 Phương pháp quan sát vi sinh vật .26 2.2.2 Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật bằng buồng đếm hồng cầu: 27 2.2.3 Phương pháp định lượng tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang .28 2.2.4 Phương pháp khảo sát khả năng tổng hợp amylase, protease ngoại bào .28 2.2.4.1 Amylase 28 2.2.4.2 Protease 29 2.2.5 Phương pháp xác định hoạt độ protease theo Anson .30 2.2.6 Phương pháp xác định hoạt độ amylase theo Heinkel 31 2.2.7 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật .33 2.2.7.1 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống trên môi trường thạch nghiêng 33 2.2.7.2 Phương pháp nuôi cấy bề sâu (nuôi cấy chìm) .33 2.2.8 Phương pháp thu nhận dịch enzyme thô 34 2.2.9 Phương pháp xác định thời gian nuôi cấy vi khuẩn để thu nhận protease và amylase có hoạt độ cao nhất 34 2.2.10 Phương pháp định danh 35 2.2.11 Phương pháp khảo sát tác dụng của chủng vi khuẩn lên môi trường nước ao nuôi cá Tra .35 2.2.12. Phương pháp xác định pH 35 2.2.13 Phương pháp xác định Carbon hữu cơ tổng số .36 2.2.14 Phương pháp xác định Tổng NH3 .37 2.2.15 Phương pháp xác định tổng chất rắn lơ lửng 39 2.2.16 Phương pháp xác định tổng lượng vi sinh 40 2.2.17 Phương pháp sử dụng phần mềm Microsoft Exel vào xử lý, tính toán các kết quả thí nghiệm 41 2.2.18 Phương pháp bố trí thí nghiệm và sơ đồ thí nghiệm .41 2.2.18.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm .41 2.2.18.2 Sơ đồ thí nghiệm .41 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .43 3.1 Phân lập, làm thuần và chọn lọc 43 3.1.1 Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn từ mẫu nước ao nuôi cá Tra .43 3.1.1.1 Phân lập và làm thuần .43 3.1.1.2 Nhuộm Gram 44 3.1.2 Định lượng khả năng tổng hợp amylase và protease của các chủng vi khuẩn phân lập được trên môi trường thạch đĩa .46 3.1.2.1 Trên môi trường tăng sinh amylase 46 3.1.2.2 Trên môi trường tăng sinh protease 48 3.1.3 Khảo sát khả năng tổng hợp amylase và protease của một số chủng cho hoạt tính cao trên môi trường lỏng 49 3.1.3.1 Khả năng tổng hợp amylase của các chủng 7, 8, 10, 12, 15.1 trên môi trường tăng sinh amylase .49 3.1.3.2 Khả năng tổng hợp protease của các chủng 3, 8, 12, 16, 26.2 trên môi trường tăng sinh protease .50 3.2 Định danh vi khuẩn .51 3.3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ amylase, protease của chủng 8 (Bacillus subtilis) khi nuôi cấy trên môi trường lỏng 52 3.3.1 pH .52 3.3.1.1 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến hoạt độ amylase .52 3.3.1.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến hoạt độ protease 53 3.3.2 Cơ chất 53 3.3.2.1 Ảnh hưởng của cơ chất lên hoạt độ amylase 53 3.3.2.2 Ảnh hưởng của cơ chất lên hoạt độ protease 54 3.3.3. Mật độ vi khuẩn .55 3.3.3.1. Ảnh hưởng của mật độ giống lên hoạt độ amylase .55 3.3.3.2. Ảnh hưởng của mật độ giống lên hoạt độ protease .56 3.3.4 Thời gian nuôi cấy 57 3.3.4.1 Khảo sát hoạt độ amylase theo thời gian nuôi cấy trên môi trường lỏng .57 3.3.4.2 Khảo sát hoạt độ protease theo thời gian nuôi cấy trên môi trường lỏng .58 3.4 Khảo sát sơ bộ khả năng tác dụng của chủng 8 lên môi trường nước ao nuôi cá Tra .59 3.4.1 Khả năng tác dụng lên pH môi trường .59 3.4.2 Khả năng tác dụng lên tổng Carbon hữu cơ (TOC) theo thời gian .60 3.4.3 Khả năng tác dụng lên tổng NH3 .62 3.4.4 Khả năng tác dụng lên tổng chất rắn lơ lửng(TSS) theo thời gian .63 3.4.5 khả năng tác dụng lên tổng lượng vi sinh vật hiếu khí .64 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .67 4.1 Kết luận .67 4.2 Đề nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO .69 PHỤ LỤC
