Thạc Sĩ Khảo sát khả năng kháng phân bào In vitro của một số chủng nấm Linh chi Ganoderma lucidum, Ganoderma

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: DI TRUYỀN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2011



Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
LỜI MỞ ĐẦU . 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Khái quát về ung thư . 3
1.1.1. Sơ lược về nguyên nhân gây ung thư . 3
1.1.2. Đặc tính của tế bào ung thư . 4
1.2. Apoptosis và ung thư 4
1.2.1. Phân biệt apoptosis với necrosis 5
1.2.2. Caspase- enzyme đóng vai trò trung tâm trong apoptosis . 7
1.2.3. Các con đường hoạt hoá caspase trong tiến trình apoptosis 11
1.2.4. Apoptosis - mục tiêu trị liệu ung thư . 17
1.3. Tóm tắt những nghiên cứu về nấm dược liệu . 19
1.3.1. Khái quát chung về nấm dược liệu . 19
1.3.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học . 24
1.3.3. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý 27
1.3.4. Nghiên cứu và ứng dụng nấm dược liệu theo hướng điều trị ung thư 31
1.4. NCI và việc sàng lọc dược liệu kháng ung thư 32

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu . 34
2.1.1. Ba dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela, ung thư vú MCF-7
và ung thư phổi NCI-H460 sử dụng trong đề tài . 34
2.1.2. Thuốc đối chiếu Camptothecin . 35
2.1.3. Nấm dược liệu . 35
2.1.4. Hóa chất 37
2.1.5. Thiết bị 40
2.2. Phương pháp . 40
2.2.1. Phương pháp thu nhận cao chiết từ nấm dược liệu 40
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật . 43
2.2.3. Phương pháp đếm tế bào với Tryphan blue 44
2.2.4. Thử nghiệm SRB 46
2.2.5. Phương pháp kính hiển vi huỳnh quang với
thuốc nhuộm kép AO/EB 50
2.2.6. Phương pháp tách chiết và điện di DNA
phân tử lượng nhỏ (phương pháp DNA phân mảnh) 51
2.2.7. Phương pháp xác định hoạt tính caspase-3 53

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

3.1. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết thô(cao chiết cồn và cao chiết nước) từ các mẫu nấm Linh chi, Vân chi, Thượng hoàng trên ba dòng tế bào ung thư
HeLa, NCI-H460 và MCF-7 57
3.1.1. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết cồn
và cao chiết nước trên dòng tế bào HeLa 57
3.1.2. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết cồn
và cao chiết nước trên dòng tế bào MCF-7 . 61
3.1.3. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết cồn
và cao chiết nước trên dòng tế bào NCI-H460 . 63
3.2. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô chiết từ nấm Linh chi vàng trên ba dòng tế bào HeLa, NCI-H460 và MCF-7 66
3.2.1. Tế bào HeLa . 67
3.2.2. Tế bào ung thư vú MCF-7 69
3.2.3. Tế bào ung thư phổi NCI-H460 70
3.2.4. Kết quả xác định cao chiết tiềm năng . 72
3.3. Xác định giá trị IC50 của cao chiết cồn nấm Linh chi vàng (Ganoderma colossum) trên dòng tế bào HeLa 73
3.4. Kết quả xác định khả năng gây apoptosis của cao chiết cồn nấm Linh chi vàng (Ganoderma colossum) trên dòng tế bào ung thư HeLa 75
3.4.1. Kết quả nhuộm huỳnh quang với thuốc nhuộm kép AO/EB 75
3.4.2. Kết quả phân tích DNA phân mảnh . 78
3.4.3. Kết quả xác định hoạt tính caspase-3 . 80

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN
Kết luận . 84
TÀI LIỆU THAM KHẢO 85
PHỤ LỤC



DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Sự khác nhau giữa apoptosis và necrosis . 5
Bảng 1.2. Các nhóm caspase và vai trò của nó trong tế bào . 8
Bảng 1.3. Thành phần hóa học của nấm Linh chi Ganoderma lucidum 24
Bảng 2.1. Các loại nấm dược liệu sử dụng trong đề tài . 35
Bảng 2.2. Độ ẩm của nguyên liệu và cao chiết 36
Bảng 3.1. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết
nước trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng . 58
Bảng 3.2. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết
nước trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 61
Bảng 3.3. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết nước
trên dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng . 63
Bảng 3.4. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn, các cao chiết
phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô chiết xuất từ nấm Linh
chi vàng trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng . 68
Bảng 3.5. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn, các cao chiết
phân đoạn có chứa triterpen và polysaccharid thô chiết xuất từ nấm Linh chi
vàng trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 69
Bảng 3.6. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn, các cao chiết phân
đoạn có chứa triterpen và polysaccharide thô chiết xuất từ nấm Linh chi vàng
trên dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng . 71
Bảng 3.7. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn nấm Linh chi vàng
trên dòng tế bào HeLa ở các nồng độ thử nghiệm sau 48 giờ cảm ứng . 74
Bảng 3.8. Kết quả hoạt tính caspase-3 của quần thể tế bào Hela ở những
thời điểm khác nhau 82

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Sự hình thành tế bào ung thư 4
Hình 1.2. Sự khác biệt hình thái giữa tế bào apoptosis và necrosis 7
Hình 1.3. Cơ chế tự hoạt hóa của caspase . 9
Hình 1.4. “Thác” caspase 10
Hình 1.5. Hai con đường khởi phát quá trình apoptosis .11
Hình 1.6. Cơ chế hoạt hóa caspase thông qua thụ thể gây chết TNF 13
Hình 1.7. Sự truyền tín hiệu apoptosis thông qua ty thể 15
Hình 1.8. Con đường khởi phát apoptosis thông qua granzyme A, B 17
Hình 1.9. Hình thái quả thể nấm Linh chi 20
Hình 1.10. Hình thái quả thể nấm Vân chi . 21
Hình 1.11. Hình thái quả thể nấm Thượng hoàng mọc trên mạt cưa . 23
Hình 2.1. Ba dòng tế bào ung thư sử dụng trong đề tài . 34
Hình 2.2. Quy trình thu nhận cao chiết phân đoạn có chứa triterpen 42
Hình 2.3. Tế bào nhuộm với Tryphan blue quan sát trong
buồng đếm hồng cầu 44
Hình 2.4. Buồng đếm hồng cầu . 45
Hình 2.5. Sự phân cắt DNA trong apoptosis . 51
Hình 2.6. Sự điện di DNA bị phân cắt trong quá trình apoptosis và necrosis trên gel agarose 52
Hình 3.1. Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100 µg/ml sau 48 giờ cảm ứng. 59
Hình 3.2. Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml sau 48 giờ cảm ứng. 62
Hình 3.3. Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml sau 48 giờ cảm ứng. 64
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao cồn trên
3 dòng tế bào Hela, MCF-7 và NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml sau 48 giờ cảm ứng . 65
Hình 3.5. Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của cao chiết cồn, các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi vàng trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 68
Hình 3.6. Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của cao chiết cồn, các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi vàng trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 70
Hình 3.7. Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của cao chiết cồn,các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi vàng trên dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng . 71
Hình 3.8. Biểu đồ so sánh tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn,các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi vàng trên 3 dòng tế bào HeLa, MCF-7 và NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml sau 48 giờ cảm ứng 72
Hình 3.9. Đồ thị thể hiện tỷ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ của cao
chiết cồn nấm Linh chi vàng trên dòng tế bào HeLa sau 48 giờ cảm ứng 74
Hình 3.10. Hình thái tế bào HeLa quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang 77
Hình 3.11. Kết quả điện di DNA bộ gen của quần thể tế bào HeLa sau khi được cảm ứng với cao chiết cồn Linh chi vàng ở nồng độ 92,6 µg/ml. . 79


LỜI MỞ ĐẦU


Theo thống kê gần đây nhất của WHO (World Health Organization), ung thư gây ra khoảng 7,9 triệu ca tử vong mỗi năm trên thế giới, trong số đó khoảng 70% (5,5 triệu người) là ở những nước đang phát triển. Ở Việt Nam, số người mắc bệnh ung thư đang có xu hướng ngày một gia tăng, ước tính mỗi năm có 75.000 người chết vì ung thư. Trong năm 2010, tại Bệnh viện Ung Bướu, phát hiện hơn 14.000 trường hợp mắc ung thư mới.
So với các loại ung thư khác, ung thư phổi chiếm tỷ lệ và gây tử vong cao nhất ở nam giới, kể cả ở các nước phát triển và đang phát triển. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, ung thư vú và ung thư cổ tử cung là hai loại ung thư thường gặp và có tỷ lệ tử vong cao nhất trong các loại ung thư phụ khoa ở nữ giới, đặc biệt là phụ nữ ở các nước đang phát triển. Tại Việt Nam, hai loại ung thư này đứng đầu trong các loại ung thư thường gặp ở nữ giới.
Cho đến nay, việc điều trị ung thư vẫn đang là một thách thức rất lớn đối với các nhà khoa học. Hiện nay để điều trị ung thư, người ta vẫn dùng ba liệu pháp phổ biến nhất là phẫu thuật, xạ trị và hóa trị. Tuy nhiên, các liệu pháp này ít nhiều cũng gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người do các tác dụng phụ. Chẳng hạn phương pháp hóa trị liệu vẫn còn bị hạn chế bởi việc liều cao của thuốc chữa ung thư có thể gây độc, làm giảm chất lượng cuộc sống của bệnh nhân [68].
Con người từ xa xưa đã biết sử dụng nhiều loại dược liệu quý trong tự nhiên để chữa bệnh. Chính vì thế, việc tìm kiếm và sàng lọc các hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng ung thư hiện nay đang là đề tài thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Các tổ chức y tế lớn trên thế giới như WHO và NCI (National Cancer Institute) đang có những dự án nghiên cứu mở rộng ra khắp các châu lục trong việc tìm kiếm các loại thuốc mới có tiềm năng điều trị được ung thư. Một trong những mục tiêu của việc tìm các hợp chất tự nhiên dùng trong điều trị ung thư hiện nay là tìm kiếm các hợp chất có khả năng cảm ứng tế bào ung thư chết theo chương trình (apoptosis).
Qua các nghiên cứu thực nghiệm và nghiên cứu lâm sàng ở người cho thấy, các nấm dược liệu như nấm Linh chi, Vân chi và Thượng hoàng có tác dụng kích thích chức năng của hệ miễn dịch và ức chế sự phát triển của khối u bằng cách làm ngừng chu trình phân bào và cảm ứng quá trình apoptosis [33],[36],[39],[44],[51],[71]; đồng thời ngăn ngừa sự di căn của các tế bào ung thư [31],[61],[63].
Ở Việt Nam, gần đây việc nuôi trồng thành công nhiều loại nấm dược liệu quý đã tạo điều kiện cho các nhà khoa học trong nước dần dần quan tâm hơn về việc nghiên cứu các loại nấm này [1],[4]. Tuy nhiên ở nước ta, việc tiếp cận theo hướng nghiên cứu thử nghiệm và sàng lọc in vitro các hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng ung thư từ các loại nấm này vẫn còn là bước đầu và chỉ mới có một vài nghiên cứu được công bố [3],[6]. Nhằm làm rõ hơn về tác dụng kháng ung thư của các loại nấm Linh Chi, Vân Chi và Thượng Hoàng nuôi trồng tại Việt Nam trên ba loại ung thư được xem là phổ biến nhất hiện nay ở nước ta, trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi tiến hành thực hiện:

- Đánh giá khả năng gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết nước của 7 mẫu nấm (Linh Chi, Vân Chi và Thượng Hoàng) trên ba dòng tế bào là ung thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung Hela và ung thư phổi NCI-H460 bằng thử nghiệm Sulforhodamine B (SRB). Từ đó, chọn ra một loại nấm có tiềm năng nhất.
- Bước đầu khảo sát khả năng gây độc trên ba dòng tế bào Hela, NCI-H460 và MCF-7 của các dịch chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharid thô trong loại nấm dược liệu tiềm năng đã được xác định ở trên bằng thử nghiệm Sulforhodamine B (SRB).
- Chọn ra một cao chiết tiềm năng có khả năng gây độc tế bào cao nhất.

Xác định khả năng cảm ứng apoptosis của cao chiết tiềm năng bằng ba phương pháp sau: