Luận Văn Khảo sát hoạt tính và tinh sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergill

TÓM TẮT KHÓA LUẬN


Đậu Thị Kim Dung, Đại học Nông Lâm Tp.HCM. Tháng 9/2006. “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN”. Đề tài được thực hiện từ ngày 10/2/2006 đến ngày 1/6/2006 tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM.
Hội đồng hướng dẫn :
PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG
TS. NGUYỄN NGOC HẢI
CN. ĐỖ THỊ TUYẾN
Chế phẩm enzyme thô dạng bột của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki được chiết bằng nước cất, thu được dịch chiết enzyme thô. Dịch chiết thô này được tủa với muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ (% độ bão hòa) : 50, 55, 60, 65, 70, 75 và cồn 960 ở các tỷ lệ dịch chiết enzyme : cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 Cặn tủa thu được hòa vào dung dịch đệm và xác định hoạt tính protease nhằm tìm ra nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa protease. Từ đó khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động của protease từ dịch tủa enzyme thu được từ nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ưu. Cuối cùng, dịch tủa pha trong đệm được chạy qua sắc ký lọc gel và xác định trọng lượng phân tử protease bằng điện di. Kết quả thu được như sau :
 Ở cả hai chủng, nồng độ muối 65% độ bão hòa và tỷ lệ cồn 1 : 4 là tối ưu để tủa protease.
 Protease của cả hai chủng hoạt động mạnh nhất ở pH = 7 và nhiệt độ 470C.
 Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae cao hơn hoạt tính của Aspegillus kawasaki.


MỤC LỤC



NỘI DUNG TRANG
Bìa i
Trang tựa ii
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt khóa luận iv
Mục lục v
Danh sách các chữ viết tắt viii
Danh sách các bảng ix
Danh sách các hình và đồ thị xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích nghiên cứu 2
1.3 Yêu cầu 2
2.1 Khái quát chung về enzyme 3
2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme 3
2.1.2 Định nghĩa về enzyme 5
2.1.3 Phân loại enzyme 6
2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme 7
2.1.4.1 Hoạt tính enzyme 7
2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme 7
2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống 9
2.1.5.1 Nguồn thu nhận 9
2.1.5.2 Vai trò 11
2.2 Khái quát chung về enzyme protease 11
2.2.1 Định nghĩa enzyme protease 11
2.2.2 Lược sử phát triển các enzyme protease 12
2.2.2.1 Protease từ động vật 12
2.2.2.2 Protease từ thực vật 12
2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật 13
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease 13
2.2.3.1 Từ động vật 13
2.2.3.2 Từ thực vật 13
2.2.3.3 Từ vi sinh vật 14
2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease 14
2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 15
2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 15
2.3.1.1 Phân loại 15
2.3.1.2 Đặc điểm 15
2.4 Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề mặt 16
2.5 Tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử enzyme protease 18
2.5.1 Trích ly enzyme 19
2.5.2 Quá trình tủa 20
2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký 22
2.5.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng phương pháp điện di SDS – PAGE 27
PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29
3.1 Thời gian và địa điểm 29
3.2 Vật liệu 29
3.2.1 Chế phẩm enzyme thô 29
3.2.2 Hóa chất 29
3.2.3 Thiết bị 29
3.3 Phương pháp thí nghiệm 30
3.3.1 Bố trí thí nghiệm 30
3.3.1.1 Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme của dịch chiết enzyme thô 30
3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ưu để tủa enzyme protease 36
3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của protease 37
3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel 37
3.3.1.5 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lượng phân tử enzyme bằng phương pháp điện di SDS – PAGE 41
3.4 Phương pháp xử lý số liệu 44
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45
4.1 Hàm lượng và hoạt tính của dịch chiết enzyme thô 45
4.2 Nồng độ muối (NH4)2SO4 tối ưu cho việc tủa protease 45
4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 46
4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki 48
4.3 Tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa protease 49
4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 49
4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki 51
4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 960 và tủa bằng muối (NH4)2SO4 53
4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease 54
4.5.1 pH tối ưu 54
4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Aspergillus oryzae 54
4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Aspergillus kawasaki 54
4.5.2 Nhiệt độ tối ưu 55
4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 55
4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki 56
4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel 56
4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae 57
4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki 59
4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki 62
4.7.1 Tủa protease bằng muối 62
4.7.2 Tủa protease bằng cồn 62
4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phương pháp điện di trên gel SDS – PAGE 63
PHẦN 5 : KẾT LUẬNVÀ ĐỀ NGHỊ 67
5.1 Kết luận 67
5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 67
5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki 67
5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki 68
5.2 Đề nghị 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO 69
PHỤ LỤC 70


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC THUẬT NGỮ

Asp.oryzae : Aspergillus oryzae
Asp.kawasaki : Aspergillus kawasaki
CP : Chế phẩm (Chế phẩm enzyme dạng bột thô do phòng vi sinh ứng dụng Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp).
CBB : Coomasie Brilliant Blue.
ĐVHT : Đơn vị hoạt tính.
HT : Hoạt tính
HTR : Hoạt tính riêng.
TCA : Trichloacetic acid
A.U : Độ hấp thụ.
mS/cm : Milisiemens/cm (đơn vị đo lường độ dẫn điện).
UI : Đơn vị hoạt tính enzyme.

DANH SÁCH CÁC BẢNG


BẢNG TRANG
Bảng 2.1 Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính của protein 22
Bảng 3.1 Đường chuẩn Albumin 32
Bảng 3.2 Đường chuẩn Tyrosine 34
Bảng 3.3 Khối lượng (NH4)2SO4 tương ứng với mỗi nồng độ 36
Bảng 3.4 Thể tích cồn tương ứng với các tỷ lệ. 36
Bảng 4.1 Hoạt tính enzyme protease và hàm lượng protein của dịch chiết enzyme thô của hai chủng Asp.oryzae và Asp. kawasaki 45
Bảng 4.2 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối 46
Bảng 4.3 Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối 46
Bảng 4.4 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối 48
Bảng 4.5 Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối 48
Bảng 4.6 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn 50
Bảng 4.7 Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn 50
Bảng 4.8 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn 51
Bảng 4.9 Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1 g chế phẩm enzyme
thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn 52
Bảng 4.10 So sánh việc tủa enzyme bằng tác nhân cồn và muối ở hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki. 53
Bảng 4.11 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo pH 54
Bảng 4.12 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo pH 55
Bảng 4.13 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo nhiệt độ 55
Bảng 4.14 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo nhiệt độ 56
Bảng 4.15 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae qua sắc ký lọc gel 59
Bảng 4.16 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki qua sắc ký lọc gel 61
Bảng 4.17 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng muối 62
Bảng 4.18 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng cồn 62
Bảng 4.19 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử của những protein trong thang. 65
Bảng 4.20 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protease ở peak 3 của Asp.oryzae 66
Bảng 4.21 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protease ở peak 2 của Asp.kawasaki 66

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ


HÌNH TRANG
Hình 2.1 Đường biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ
phản ứng 8
Hình 2.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ
cơ chất 8
Hình 2.3 Công thức cấu tạo enzyme protease 11
Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi 16
Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae sau bảy ngày nuôi cấy trên môi trường CBS – MEA2%. 16
Hình 2.6 Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký 23
Hình 2.7 Quá trình lọc gel 26
Hình 3.1 Máy quang phổ UV-Vis 31
Hình 3.2 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ 38
Hình 4.1 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P-100 khi tủa protease bằng muối đối với nấm Aspergillus oryzae 58
Hình 4.2 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng cồn đối với nấm Aspergillus oryzae 58
Hình 4.3 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng muối đối với nấm Aspergillus kawasaki 60
Hình 4.4 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa protease bằng cồn đối với Aspergillus kawasaki 60


ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1 Đồ thị so sánh hàm lượng protein và hoạt tính enzyme protease trong dịch chiết enzyme thô giữa hai chủng nấm mốc Asp.oryzae và Asp.kawasaki 45
Đồ thị 4.2 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối 47
Đồ thị 4.3 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối 49
Đồ thị 4.4 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn 51
Đồ thị 4.5 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn 52
Đồ thị 4.6 Ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.oryzae. 54
Đồ thị 4.7 Ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.kawasaki 55
Đồ thị 4.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.oryzae 55
Đồ thị 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.kawasaki. 56
Đồ thị 4.10 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bước tinh sạch khi tủa protein bằng muối. 62
Đồ thị 4.11 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bước tinh sạch khi tủa protease bằng cồn. 63
Đồ thị 4.12 Sự tương quan giữa Lg của trọng lượng phân tử và giá trị Rf. 65

PHẦN 1 : MỞ ĐẦU


1.2 Đặt vấn đề
Để duy trì sự sống, cơ thể mỗi sinh vật phải thực hiện rất nhiều phản ứng hóa sinh. Như vậy điều gì đã giúp các phản ứng này được tiến hành mau lẹ phi thường mà vẫn nhịp nhàng cân đối. Đó là nhờ khả năng xúc tác và điều hòa to lớn của enzyme.
Có bản chất là một protein, enzyme không chỉ có thể thực hiện khả năng xúc tác sinh học bên trong cơ thể mà còn có thể thực hiện các xúc tác bên ngoài cơ thể khi tạo cho chúng một điều kiện thích hợp để hoạt động. Bởi lẽ đó, trong vòng vài chục năm gần đây việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzyme trên thế giới đã phát triển với tốc độ rất mạnh mẽ.
Nhân tố quan trọng có tác dụng thúc đẩy cho sự phát triển của nền công nghiệp sản xuất enzyme đó là khả năng to lớn của vi sinh vật - những nhà máy chế tạo enzyme. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh do đó có khả năng tạo ra một lượng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme do chúng tạo ra có hoạt lực cao và chúng ta có thể tận dụng các phế thải của ngành khác để làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme.
Protease là một trong những nhóm enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và phổ biến trong đời sống. Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học Hoạt tính của enzyme nói chung và của protease nói riêng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Điều kiện tối thích để mỗi loại enzyme hoạt động là khác nhau. Do đó, để sử dụng enzyme hiệu quả nhất cần khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu cho hoạt động của enzyme đó. Nhằm mục đích khảo sát hoạt tính protease và tìm hiểu về kĩ thuật sắc ký lọc gel dùng trong việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài :“Khảo sát hoạt tính và tinh sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki trên môi trường bán rắn”.
Aspergillus oryzae từ lâu đã được dùng như là nguồn vi sinh vật được nuôi cấy để thu nhận enzyme protease. Tuy nhiên, đối với Aspergillus kawasaki thì người ta chỉ biết đến như là nguồn vi sinh vật để thu nhận amylase. Do đó, qua đề tài, chúng ta có thể đánh giá được hiệu quả sử dụng protease của chủng Aspergillus kawasaki.
1.2 Mục đích nghiên cứu.
 Xác định các điều kiện thu nhận và đặc tính của enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspgillus kawasaki.
 So sánh hoạt tính enzyme protease giữa hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki.
1.3 Yêu cầu.
 Thu nhận enzyme , xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa và tỷ lệ cồn tối ưu trong việc tủa enzyme - bước đầu trong quá trình tinh sạch enzyme.
 Xác định pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme protease.
 Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.
 Xác định trọng lượng phân tử của enzyme protease bằng kỹ thuật điện di SDS – PAGE.