Thạc Sĩ Khảo sát đáp ứng miễn dịch ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đối với protein màng OmpN tái tổ h

LỜI MỞ ĐẦU

Trong nền kinh tế Việt Nam, thủy sản là thế mạnh và là ngành kinh tế mũi nhọn. Với hơn 3260 km bờ biển, 112 cửa sông, lạch, hơn 2 triệu km2 thềm lục địa, hơn 1triệu km2 mặt nước, sự phong phú về các loại thủy sản nên ngành thủy sản của nước ta có điều kiện rất thuận lợi để phát triển và thực tế nó đã trở thành một bộ phận quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Trong những năm qua, ngành thủy sản đã đạt được tốc độ phát triển cao, ổn định và mức tăng tổng bình quân hàng năm về tổng sản lượng thủy sản trên 4% năm, giá trị kim ngạch xuất khẩu bình quân chiếm 10-15% trong tổng kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam hàng năm. Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá da trơn nước ngọt có giá trị kinh tế cao, phân bố tự nhiên tập trung chủ yếu ở vùng hạ lưu sông Mekong. Ở Việt Nam đối tượng này được nuôi với quy mô công nghiệp ở một số tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) như: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang . [2].
Từ năm 1996 – 2006, diện tích nuôi cá tra, basa tăng gấp 7 lần, sản lượng tăng 36,2 lần. Hiện nay, cá tra đã được xuất khẩu sang 80 quốc gia và vùng lãnh thổ, chiếm 29% giá trị xuất khẩu thủy sản của cả nước [13]. Để có sản lượng cao cung cấp cho xuất khẩu, bên cạnh việc tăng diện tích nuôi trồng thì người dân còn nuôi cá tra ở mật độ cao và nuôi thâm canh, làm xuất hiện nhiều loại bệnh trên cá. Trong đó, bệnh gan thận mủ gây thiệt hại nghiêm trọng nhất cho người nuôi [4].
Bệnh gan thận mủ xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào năm 1998. Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết cao khoảng 10-90%, và có thể lên tới 100% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi [2]. Khi cá bệnh, người nuôi thường dùng thuốc hóa học và thuốc kháng sinh để chữa trị. Tuy nhiên, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh cho cá kháng với một số loại thuốc kháng sinh như Oxytetracylin, Oxolinic acid, Sulphonamid Hơn thế, các sản phẩm thủy sản sau đó thường không được ưa chuộng do sự tích lũy thuốc, hóa chất trong thịt, tạo chủng kháng thuốc.
Việc tìm kiếm các loại vaccine cho cá tra kháng lại bệnh gan thận mủ là vấn đề cấp bách cho công nghiệp nuôi cá ở Việt Nam. Một trong những hướng nghiên cứu để sản xuất vaccine là sản xuất vaccine tiểu phần bằng cách sử dụng protein màng (outer membrane protein - Omp) của vi khuẩn E. ictaluri. Sản xuất vaccine tiểu phần từ OmpN để phòng ngừa bệnh trên cá da trơn là một hướng phát triển có nhiều tiềm năng. Protein OmpN là một tiểu phần của E. ictaluri, trợ giúp cho quá trình bám dính, là một kháng nguyên quan trọng kích thích đáp ứng miễn dịch [5]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ dừng ở bước đánh giá đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với protein màng ompN nhằm tạo tiền đề cho việc sản xuất vaccine tiểu phần ngừa bệnh gan thận mủ cho cá tra.
Từ những thực tế trên, chúng tôi mạnh dạn tiến hành đề tài “Khảo sát đáp ứng miễn dịch ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đối với protein màng OmpN tái tổ hợp của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri”
Mục tiêu của đề tài
Khảo sát đáp ứng miễn dịch ở cá Tra đối với protein màng OmpN tái tổ hợp của vi khuẩn E. ictaluri
Nội dung đề tài bao gồm
- Tinh sạch protein OmpN tái tổ hợp từ hệ thống biểu hiện E. coli
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN
- Tạo dòng nấm men Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN

MỤC LỤC

MỤC LỤC . i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . iv
DANH MỤC CÁC BẢNG . v
DANH MỤC CÁC HÌNH . vi
DANH MỤC SƠ ĐỒ viii
LỜI MỞ ĐẦU . 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tình hình nuôi cá tra và bệnh gan thận mủ 3
1.2. Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mũ
trên cá Tra. 5
1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 5
1.2.2. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri . 6
1.3. Sơ lược về protein màng và vai trò của protein màng OmpN
(outer membrane protein N) trong vi khuẩn Edwarsiella ictaluri 8
1.3.1. Sơ lược về protein màng . 8
1.3.2. Protein màng OmpN của vi khuẩn E. ictaluri 9
1.4. Tình hình nghiên cứu vaccine kháng khuẩn Edwardsiella ictaluri
cho cá Tra . 13
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 14
1.5. Sơ lược về các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp . 16
1.5.1. Hệ thống vi khuẩn E. coli 16
1.5.2. Hệ thống nấm men Pichia pastoris . 17
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 20
2.1. Thiết bị, hóa chất và dụng cụ 20
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ 20
2.1.2 Hóa chất và môi trường . 21
2.1.2.1. Hóa chất và môi trường dùng để biểu hiện OmpN trong hệ thống E.
coli . 21
2.1.2.2. Hóa chất dùng trong tinh sạch OmpN tái tổ hợp từ E. coli . 21
2.1.3. Chủng vi sinh vật . 26
2.1.3.1. Chủng vi khuẩn Escherichia coli: . 26
2.1.3.2. Chủng nấm men Pichia pastoris . 26
2.1.4. Các plasmid 26
2.1.5.1. Plasmid pET 28 . 26
2.1.5.2. Plasmid pPIC9K . 28
2.2. Phương pháp nghiên cứu . 30
2.2.1. Thu nhận và khảo sát gây đáp ứng miễn dịch ở cá tra
của OmpN tái tổ hợp trên hệ thống E.coli 30
2.2.1.1. Biểu hiện protein OmpN trong E. coli 30
2.2.1.2. Thu nhận protein OmpN từ hệ thống biểu hiện E. coli . 31
2.2.1.3. Đánh giá đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN . 32
2.2.2. Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN 35
2.2.2.1. Tạo dòng E. coli DH5α mang đoạn gen OmpN 36
2.2.2.2. Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN . 38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN . 40
3.1. Kết quả thu nhận OmpN tái tổ hợp trên hệ thống E. coli 40
3.1.1. Biểu hiện protein OmpN trong E. coli . 40
3.1.2. Tinh sạch protein OmpN từ hệ thống biểu hiện E. coli . 42
3.1.2.1. Mức độ hòa tan của protein OmpN ở dạng thể vùi với urea 42
3.1.2.2. Tinh sạch protein OmpN bằng sắc ký ái lực . 43
3.1.2.3. Loại muối dung dịch protein OmpN tinh sạch bằng sắc lý lọc gel
Superfine Sephadex G-25 50
3.1.3. Khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN 51
3.1.3.1. Kiểm tra kháng thể kháng OmpN từ thỏ bằng phương pháp Western blot . 51
3.1.3.2. Kết quả khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN . 52
3.2. Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN 55
3.2.1. Tạo dòng E. coli DH5α mang plasmid PIC9K nối với đoạn gen
OmpN. 55
3.2.1.1. Thu nhận đoạn gen OmpN và pPIC9K từ chủng E. coli DH5α 55
3.2.1.2. Tạo dòng chủng E. coli DH5α mang đoạn gen OmpN nối với
pPIC9K 57
3.2.2. Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN 59
3.2.3. Kết quả sàn lọc dòng tế bào nấm men P. pastoris có khả năng biểu
hiện ompN cao 63
CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 65
4.1. Kết luận . 65
4.2. Kiến nghị . 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 66