Tài liệu Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym b-galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis B

ĐỀ TÀI: Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym b-galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16


NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

ONPG : o-nitrophenil-b-D-galactopyranoside.
X-Gal : 5-bromo-4chloro-3-indolyl-b-D-galactoside.
SDS : sodium dodecyl sunfate.
ONPG : p-nitrophenil-b-D-galactopyranoside.
GO : oligosaccarit.
DEAE : dietylaminoetylxelluloza.

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 3
PHẦN I: TỔNG QUAN . 5
I.1. Sơ lược về enzym b-galactosidaza 5
I.1.1. Vi sinh vật có khả năng tổng hơp enzym b-galactosidaza 5
I.1.2. Đặc tính enzym b-galactosidaza từ vi sinh vật . 6
I.2. Các nguồn enzym b-galactosidaza . 7
I.2.1. Enzym b-galactosidaza từ vi khuẩn 7
I.2.2. Enzym b-galactosidaza từ nấm mốc . 8
I.2.3. Enzym b-galactosidaza từ thực vật 8
I.3.Một số cơ chế của các phản ứng được xúc tác bởi enzym b-galactosidaza . 9
I.3.1. Cơ chế động học của phản ứng ONPG 9
I.3.2. Cơ chế động học của phản ứng lactoza 10
I.3.3. Cơ chế thuỷ phân lactoza của b-galactosidaza có pH trung tính 11
I.4. Sự điều hoà sinh tổng hợp enzym b-galactosidaza của vi sinh vật 13
I.5. Tách chiết và tinh chế enzym . 14
I.5.1. Tách chiết . 14
I.5.2. Tinh chế 14
I.6. Ứng dụng của enzym b-galactosidaza . 16
I.6.1. Ứng dụng để thuỷ phân lactoza trong công nghiệp chế biến sữa và các thành phần của sữa 16
I.6.2. Sử dụng phản ứng chuyển hoá galactozyl tạo ra các oligosacarit từ lactoza 19
I.6.3. Sử dụng trong sinh học phân tử và kỹ nghệ protein . 20
I.7. Nguồn thu từ enzym công nghiệp trong tương lai . 21
I.8. Khả năng ứng dụng của enzym b-galactosidaza trong tương lai . 22
PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 23
II.1. Nguyên liệu . 23
II.2. Hoá chất 24
II.3. Thiết bị 24
II.4. Các phương pháp nghiên cứu . 25
II.4.1. Nhuộm gram 25
II.4.2. Xác định định tính enzym b-galactosidaza bằng chỉ thị X-Gal . 27
II.4.3. Xác định hoạt độ enzym b-galactosidaza nội bào 27
II.4.4. Xác định hoạt độ enzym b-galactosidaza ngoại bào 30
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 32
III.1. Vài nét về chủng vi khuẩn sử dụng . 32
III.2. Nghiên cứu khả năng đồng hoá các nguồn cácbon khác nhau 33
III.3. Khảo sát sự thay đổi pH, mật độ tế bào, hoạt độ enzym của chủng S.paucimobilis BK16 trong quá tŕnh lên men 35
III.4. Xác định một số đặc tính enzym b-galactosidaza thu được . 38
III.4.1. Ảnh hưởng của pH phản ứng tới hoạt độ của enzym . 38
III.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt độ của enzym . 40
III.4.3. Ảnh hưởng của pH tới tính bền của enzym . 41
III.4.4. Ảnh hưởng của pH tới tính bền của enzym . 42
III.5. Nghiên cứu khả năng thu enzym nội bào 43
III.6. Nghiên cứu khả năng kết tủa enzym bằng muối amonsunfat 45
KẾT LUẬN 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 47

Lời mở đầu


Sữa là một thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giúp cho sự hấp thụ phospho và canxi cao, có tính kháng thể mạnh, do vậy rất tốt cho trẻ em và người già. Lactoza là disccarit chiếm chủ yếu trong thành phần sữa. Sự có mặt của lactoza trong quá tŕnh chế biến thực phẩm đôi khi không có lợi, gây sẫm màu và tạo ra mùi không mong muốn đối với sản phẩm khi gia nhiệt, làm ảnh hưởng tới chất lượng cảm quan do sự tái kết tinh của chúng. Sau khi dùng sữa, lactoza được enzym b-galactosidaza trong ruột non của người phân giải thành glucoza và galactoza. Tuy nhiên năng lực tổng hợp enzym trên ở người bị mất dần khi qua tuổi cai sữa. Kết quả là đại đa số người trưởng thành và người già trên thế giới đều mắc bệnh thiểu năng chuyển hóa lactoza. Nghĩa là, ở những người này khi sử dụng nhiều sữa sẽ có các triệu chứng nh­ đầy hơi, chướng bụng, đau bụng, tiêu chảy, buồn nôn. V́ vậy các hướng giải quyết được đặt ở đây là:
· Phát triển các sản phẩm sữa có hàm lượng lactoza giảm để những người mắc bệnh thiểu năng chuyển hóa lactoza có thể sử dụng được.
· Dùng trực tiếp các chế phẩm enzym dưới dạng thực phẩm nhằm tăng hoạt độ enzym b-galactosidaza trong ruột non.
Để thuỷ phân chuyển hóa lactoza thành glucoza và galactoza có thể dùng axit hoặc enzym b-galactosidaza. Việc thuỷ phân bằng axit dẫn đƠn một số bất lợi nh­ hao ṃn thiết bị, ô nhiễm môi trường, gây khó khăn cho việc đảm bảo an toàn thực phẩm mà phương pháp enzym hoàn toàn có thể khắc phục được.
Ngoài ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, tiềm năng ứng dụng của enzym b-galactosidaza trong các lĩnh vực nghiên cứu cơ bản, trong sinh học phân tử và kỹ nghệ protein (làm các gen thông báo, chỉ thị, các phân tử cảm biến .), trong sản xuất dược phẩm và trong y học là rất lớn.
Chính v́ vậy, việc nghiên cứu nhằm sản xuất ra các chế phẩm enzym
b-galactosidaza là hết sức cần thiết, nhất là trong công nghiệp chế biến sữa.
Đề tài “Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym
b-galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16” nhằm những mục đích sau:
· Khảo sát đặc tính sinh enzym của chủng S. paucimobilis BK16.
· Nghiên cứu lựa chọn nguồn cacbon thích hợp cho quá tŕnh sinh tổng hợp enzym b-galactosidaza chủng S. paucimobilis BK16.
· Xác định một số đặc tính của enzym b-galactosidaza thu đ­ược từ chủng S. paucimobilis BK16.
· Nghiên cứu khả năng thu enzym kỹ thuật.
















Phần I

Tổng quan


I.1. SƠ LƯỢC VỀ ENZYM b-GALACTOSIDAZA:
Enzym b-galactosidaza là enzym xúc tác cho quá tŕnh thuỷ phân và chuyển hóa các gốc b-D-galactozyl, trong đó có sự thủy phân lactoza thành glucoza và galactoza [6].
Enym b-galactosidaza có trong nhiều tổ chức bao gồm các vi sinh vật, thực vật và động vật. Các enzym này đă được ứng dụng trong nhiều quá tŕnh công nghệ sinh học, đặc biệt là các enzym từ vi sinh vật được sử dụng để thủy phân lactoza nhằm làm tăng khả năng tiêu hóa sữa hoặc để cải thiện các đặc tính chức năng của các sản phÈm từ sữa. Phản ứng chuyển hoá galactozyl cũng thường được sử dụng để tạo ra các galacto-oligosaccrit nhằm cải biến về mặt chức năng và cấu trúc của nguyên liệu thực phẩm, dược phẩm và các hợp chÊt có hoạt tính sinh học khác [6].
Trên thế giới hiện nay đă có rất nhiều công tŕnh nghiên cứu về enzym b-galactosidaza, chủng vi sinh vật tổng hợp nên nó, đặc tính enzym, phương pháp tách chiết, tinh chế và ứng dụng nó trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp thực phẩm, trong y học và dược phẩm cũng như cả trong lĩnh vực nghiên cứu cơ bản. Mặc dù vậy, ở nước ta, việc nghiên cứu về enzym này mới chỉ là bước đầu và ứng dụng của chúng rất Ưt được đề cập đến.
I.1.1. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp b-galactosidaza :
Hiện nay các nhà nghiên cứu đă t́m ra được nhiều chủng loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym b-galactosidaza với hoạt lực cao. Enzym khi được tổng hợp có thể ở dạng ngoại bào (tiết ra ngoài môi trường) hoặc nội bào (tích tụ trong tế bào, có thể ở dạng tự do hoặc ở dạng liên kết với màng, với plasma hoặc lyzosome của tế bào ) [6].

Bảng 1: Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzym b-galactosidaza:

[TABLE=width: 655]
[TR]
[TD]NẤM MEN[/TD]
[TD]Candida pseudtropicalis, Crypotoccus laurentii, Kluyverromyces lactics, K.fragilis, K.marxianus, Torulopsis sphaerica, T.versalitis [/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]NẤM MỐC[/TD]
[TD]Asperigillus awmori, A.cellulosae, A.foetidus, A.niger, A.oryzae, Chaetomium globosum, C.funicola, Fusarium maniforme, Penicillum canescens, Rhizopus acidus, R.niveus, [/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]VI KHUẨN[/TD]
[TD]Vi khuẩn gram âm: Sphigomonas Paucimobilis, Aeromonas cavie, A.formicans, Agrobacterrium rediobacter, Enterobacter cloacae, Escerichia coli, Fibrobacter succinogenes, Xanthomonas campertris, [/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]Vi khuẩn gram dương: Bacillus acidocaldarius, B.circulans, B.coagulans, B.macerans, B.subtilis, Clostridium acetobutylicum, Corynebacterrium murisepticum, Lactococcus pneumonira, [/TD]
[/TR]
[/TABLE]

I.2 Đặc tính của enzym b-galactosidaza từ vi sinh vật:

Khối lượng phân tử của enzym dao động từ 19.000 đến 630.000 Dalton. Cấu trúc dưới phân tử của các enzym này bao gồm nhiều loại khác nhau từ monomer (enzym từKluyveromces lactic) đến octamer (enzym từ E.coli) [4].
Tuỳ thuộc vào nguồn thu enzym mà tính đặc hiệu phân tử của từng loại enzym là khác nhau. Các enzym b-galactosidaza có nguồn gốc từ vi khuẩn có pH tối ưu thuộc vùng trung tính, trong khi đó hầu hết các enzym b-galactosidaza từ nấm mốc có pH thuộc vùng axit, có một số chủng đạt tới pH tối ưu là pH=2 [15].
Một sè enzym b-galactosidaza từ vi khuẩn để có hoạt tính cần phải có mặt các ion hoá trị 1 và các ion hoá trị 2, ví dụ như enzym b-galactosidaza từ S. rectivirgulacần phải có mặt nhiều ion kim loại hoá trị 2 để đạt đến độ bền nhiệt và hoạt tính tối đa. Tuy nhiên một số enzym b-galactosidaza khác lại không cần sự có mặt của các ion kim loại như enzym từ Rhizobium melioti [15].
Những điểm trên cho ta thấy tính đa dạng của enzym b-galactosidaza vi sinh vật.

I.2. CÁC NGUỒN ENZYM b-GALACTOSIDAZA:

Mặc dù rất nhiều enzym b-galactosidaza từ vi sinh vật được biết đến nhưng chỉ có một số Ưt các vi sinh vật được lựa chọn làm nguồn sinh enzym trong công nghiệp. Hầu hết các vi sinh vật này có nguồn gốc từ nấm mốc nh­ là Kluyveromyces lactic, K.fragilis, Aspergillus niger và A.oryzae hoặc từ vi khuẩn nh­ E.coli. Những loài vi sinh vật đó được lựa chọn chính v́ chúng có thể tạo ra enzym b-galactosidaza với giá rẻ và an toàn khi cho thêm vào thực phẩm [5].
Enzym từ vi sinh vật, thực vật được ứng dụng rất rộng răi trong các quá tŕnh công nghệ sinh học.
I.2.1. Enzym từ vi khuẩn: