Thạc Sĩ Khảo sát ảnh hưởng của chế độ xử lí Demecolcine lên kết quả loại nhân tế bào trứng lợn phục vụ cho n

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NĂM 2010

MỤC LỤC

Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các từ viết tắt
Danh mục hình
Danh mục bảng
Danh mục biểu đồ
Đặt vấn đề

Phần I: Tổng quan tài liệu

1.1. Tế bào trứng, vai trò của nhân, nguyên sinh chất trong quá trình hình thành, phát triển tế bào trứng và nhân bản vô tính . 1
1.1.1. Sự hình thành và phát triển tế bào trứng 1
1.1.2. Sự thành thục của tế bào trứng 2
1.1.2.1. Sự thành thục nhân . 3
1.1.2.2. Sự thành thục tế bào chất . 3
1.1.3. Hoạt động phân tử của tế bào trứng . 4
1.1.3.1. MPF-nhân tố phát động chín trứng 4
1.1.3.2. CSF-nhóm ức chế tế bào 5
1.1.3.3. MAP kinase 6
1.1.3.4. APC- phức hợp phát động anaphase 6
1.1.4. Sự tái thiết lập chương trình khi thực hiện cấy nhân . 6
1.2. Đại cương về loại nhân trong nhân bản vô tính động vật . 7
1.2.1. Loại nhân bằng phương pháp “mò mẫm” (“Blind” enucleation) 7
1.2.2. Loại nhân với thuốc nhuộm Hoechst và ánh sáng tia cực tím . 8
1.2.3. Loại nhân bằng phương pháp li tâm thang nồng độ (Centrifugation educleation) 8
1.2.4. Loại nhân bằng phương pháp telophase (Telophase enucleation) . 9
1.2.5. Loại nhân bằng phương pháp sử dụng hóa chất hỗ trợ (Chemical assistant enucleation) 10
1.2.5.1. Tổng quan về demecolcine . 11

1.2.5.2. Tính chất của demecolcine . 11
1.3. Nhân bản vô tính lợn . 12
1.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân bản vô tính ở lợn . 14
1.3.1.1. Tế bào cho 14
1.3.1.2. Kĩ thuật chuyển nhân . 14
1.3.1.3. Hoạt hóa . 15
1.3.1.4. Sự tái thiết lập chương trình và phát triển phôi lợn . 16
1.3.2. Những thay đổi khi loại nhân bằng phương pháp sử dụng demecolcine trong nhân bản vô tính ở lợn . 17
1.3.3. Chuẩn bị tế bào nhận . 17
1.4. Nhân bản vô tính ở Việt Nam . 21

Phần II: Vật liệu- phương pháp

2.1. Đối tượng thí nghiệm 23
2.2. Dụng cụ và thiết bị 23
2.2.1. Dụng cụ . 23
2.2.2. Thiết bị 24
2.3. Hóa chất và môi trường 25
2.3.1. Hóa chất 25
2.3.2. Môi trường 25
2.3.2.1. Môi trường thu nhận buồng trứng 25
2.3.2.2. Môi trường thu nhận và rửa tế bào trứng . 26
2.3.2.3. Môi trường nuôi thành thục trứng in vitro . 26
2.3.2.4. Môi trường ủ tế bào trứng trước khi loại nhân 26
2.3.2.5. Môi trường loại nhân tế bào trứng . 26
2.4. Phương pháp . 27
2.4.1. Phương pháp thu nhận buồng trứng lợn 28
2.4.2. Thu nhận tế bào trứng lợn . 29
2.4.2.1. Thu nhận bằng phương pháp chọc hút . 29
2.4.2.2. Thu nhận bằng phương pháp cắt nang . 29

2.4.3. Phương pháp nuôi thành thục trứng in vitro . 30
2.4.4. Phương pháp loại tế bào cumulus . 31
2.4.5. Phương pháp khảo sát nồng độ demecolcine thích hợp cho loại nhân32
2.4.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng thời gian thích hợp cho việc loại nhân . 32
2.4.7. Ảnh hưởng của thời gian IVM đến kết quả loại nhân . 32
2.4.8. Khảo sát ảnh hưởng của demecolcine kết hợp cytochalasin B lên tế bào trứng . 33
2.4.10. Phương pháp loại nhân tế bào . 33
2.4.10.1. Phương pháp ép đẩy . 34
2.4.10.2. Phương pháp xử lí demecolcine và kết hợp hút nhân 35
2.4.11. Phương pháp nhuộm Hoechst 33342 . 37
2.4.12. Phương pháp thống kê 37

Phần III: Kết quả -biện luận

3.1. Kết quả thu và nuôi trứng thành thục . 38
3.1.1. Kết quả thu trứng 38
3.1.2. Kết quả nuôi trứng thu được bằng phương pháp cắt nang 40
3.1.3. Kết quả nuôi trứng thu được bằng phương pháp chọc hút 41
3.1.4. So sánh hiệu quả của 2 phương pháp 42
3.2. Ảnh hưởng của nồng độ demecolcine lên tế bào trứng 45
3.3. Kết quả khảo sát thời gian xử lí demecolcine thích hợp cho loại nhân 48
3.4. Ảnh hưởng của thời điểm xử lí loại nhân tế bào trứng bằng demecolcine . 49
3.5. So sánh hiệu quả loại nhân giữa phương pháp ép- đẩy và phương pháp xử lí demecolcine kết hợp với hút nhân 52
3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của demecolcine và cytochalasin B lên hiệu quả tạo chỗ nhô của tế bào trứng 56

Phần IV: Kết luận-đề nghị

Tài liệu tham khảo
Phụ lục


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu tạo tế bào trứng lợn . 1
Hình 1.2. Các giai đoạn của quá trình sinh trứng 2
Hình 1.3. Các giai đoạn thành thục của nhân 3
Hình 1.4. Hoạt động của phân tử MPF trong tế bào trứng 4
Hình 1.5. Vai trò của CSF trong tế bào trứng 5
Hình 1.6. Công thức cấu tạo demecolcine . 11
Hình 1.7. So sánh giữa sinh sản tự nhiên và sinh sản vô tính 12
Hình 1.8. Mô hình gen trị liệu khi sử dụng lợn nhân bản vô tính 13
Hình 1.9. Các bước trong kĩ thuật nhân bản vô tính lợn 14
Hình 2.1. Hệ thống vi thao tác và kính hiển vi đảo ngược 24
Hình 2.2. Tủ đựng hóa chất 25
Hình 2.3. Máy mài kim 25
Hình 2.4. Máy tạo dáng kim 25
Hình 2.5. Máy kéo kim . 25
Hình 2.6. Tủ thao tác vô trùng . 25
Hình 2.7. Buồng trứng lợn . 28
Hình 2.8. Hình dạng các tế bào trứng loại A, B, C . 30
Hình 2.9. Các bước loại bỏ tế bào cumulus của tế bào trứng 31
Hình 2.10. Các bước loại nhân bằng phương pháp ép- đẩy . 35
Hình 2.11. Đĩa 4 giếng có vi giọt và đĩa Φ90 có phủ dầu khoáng 35
Hình 2.12. Các bước loại nhân tế bào trứng bằng cách hút . 37
Hình 3.1. Tế bào trứng đã xử lí demecolcine . 47
Hình 3.2. Hình dạng tế bào trứng thay đổi theo thời gian xử lí demecolcine .49
Hình 3.3. Tế bào trứng ở các thời gian IVM khác nhau 51
Hình 3.4. Tế bào trứng 30-32 giờ (xử lí demecolcine) 52

Hình 3.5. Hình dạng tế bào trứng sau khi loại nhân ép - đẩy 52
Hình 3.6. Kết quả nhuộm với Hoechst 33342 sau khi loại nhân . 53
Hình 3.7. Hình dạng tế bào trứng sau khi loại nhân bằng cách hút . 54
Hình 3.8. Kết quả nhuộm Hoechst 33342 sau khi xử lí demecolcine, loại nhân . 54
Hình 1. Máy kéo iii
Hình 2. Hệ thống máy mài và ảnh kim đang được mài qua thị kính iv
Hình 3. Kĩ thuật cắt đầu kim . v
Hình 4. Kĩ thuật tạo kim giữ . v
Hình 5. Kĩ thuật tạo đầu nhọn kim tiêm vi
Hình 6. Bẻ cong kim thao tác và góc bẻ cong vi


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành tựu nhân bản vô tính lợn từ 2000-2006 19
Bảng 2.1. Các dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm 23
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 24
Bảng 2.3. Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ De và CB . 33
Bảng 3.1. Kết quả phương pháp cắt nang và phương pháp chọc hút. 38
Bảng 3.2. Kết quả nuôi trứng in vitro thu được ở phương pháp cắt nang 40
Bảng 3.3. Kết quả nuôi trứng in vitro thu được ở phương pháp chọc hút . 41
Bảng 3.4. So sánh 1 số chỉ tiêu của 2 phương pháp . 42
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát nồng độ demecolcine . 45
Bảng 3.6. Ảnh hưởng thời gian xử lí demecolcine 48
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời điểm xử lí demecolcine 50
Bảng 3.8. Kết quả loại nhân bằng phương pháp ép - đẩy 53
Bảng 3.9. Kết quả xử lí loại nhân bằng demecolcine kết hợp với hút nhân . 54
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của De và CB lên hiệu quả tạo chỗ nhô 56


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. So sánh tỉ lệ trứng của 2 phương pháp . 43
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ demecolcine 46
Biểu đồ 3.2. So sánh 2 phương pháp loại nhân 55


ĐẶT VẤN ĐỀ

Không phải ngẫu nhiên mà các nhà khoa học đều dự đoán rằng thế kỉ XXI sẽ là thế kỉ của công nghệ sinh học. Những năm cuối của thế kỉ XX và đầu của thế kỉ XXI nhân loại đã bắt đầu chứng kiến những thành tựu mang tính bước ngoặt và đột phá trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Ngày 5/7/1996, đã đi vào lịch sử ngành công nghệ sinh học thế giới với sự ra đời của cừu Dolly, động vật có vú đầu tiên trên thế giới được sinh ra bằng phương pháp nhân bản vô tính. Sự kiện này đánh dấu một bước tiến nhảy vọt trong lĩnh vực nhân bản vô tính, đồng thời mở ra một trang sử mới cho nhân loại. Tiếp theo cừu Dolly các nhà khoa học của các nước Mỹ, Nhật Bản, Ý, Anh, Hàn Quốc, đã bắt đầu điền tên mình lên bản đồ nhân bản vô tính động vật trên thế giới bằng những thành công trên các đối tượng động vật khác như: bò, chuột, ngựa, lợn, dê, thỏ, khỉ, Những thành công bước đầu này sẽ góp phần quan trọng vào việc sử dụng các cơ quan thay thế cho con người, tìm hiểu cơ chế của sự lão hóa, nghiên cứu mô hình bệnh lí, bảo tồn động vật quí hiếm hoặc đã bị tiệt chủng.

Mặc dù có những bước đầu thành công đáng khích lệ nhưng tế bào động vật luôn được xem là “Cỗ máy kì diệu và bí ẩn của tự nhiên”. Vì thế, những khám phá và thành công chỉ mới là bước đầu. Bên cạnh đó, những khiếm khuyết về mặt di truyền cũng như về kĩ thuật và phương pháp dẫn đến tỉ lệ thành công của phương pháp nhân bản vô tính hiện nay rất thấp, chỉ từ 1-2% vào năm 2000, (Tsunoda và cs., 2000), tới 7-8% năm 2006 (Vajta và cs.,2006). Trong đó, tỉ lệ thành công trong nhân bản vô tính lợn cũng không phải là ngoại lệ. Mặc dù vậy nhưng nhân bản vô tính lợn lại rất được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm với hi vọng chúng sẽ trở thành cứu tinh cho con người trong việc thay thế và ghép nội tạng. Con lợn đầu tiên ra đời bằng phương pháp nhân bản vô tính trên thế giới được ghi nhận năm 2000. Từ đó, đã có nhiều cải tiến về mặt kĩ thuật và phương pháp để dần hoàn thiện nhằm nâng cao tỉ lệ thành công.
Hai loại tế bào cần thiết cho quá trình nhân bản vô tính là tế bào cho nhân (donor nucleus - karyoplast) và tế bào trứng nhận (recipient oocytes - cytoplast) rất được quan tâm. Tế bào trứng nhận chứa đầy đủ các thành phần cần thiết cho phép nhân tế bào cho tái lập trình (reprogramming). Vì vậy, loại nhân là chìa khóa quan trọng cho sự thành công của nhân bản vô tính động vật. Trong qui trình nhân bản vô tính thì khâu loại nhân (enucleation) là một khâu then chốt, nó có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển phôi cũng như tỉ lệ thành công trong kĩ thuật nhân bản vô tính (Ibánẽz và cs., 2003). Có nhiều phương pháp loại nhân được đưa ra, bổ sung, phát triển và hoàn thiện với mục đích nhằm nâng cao tỉ lệ thành công trong việc tạo động vật nhân bản vô tính. Tại Việt Nam, cùng với xu thế khoa học trên thế giới, các nhà khoa học trong nước tại Viện Công nghệ sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học quốc gia TPHCM cũng đã từng bước tiếp cận với kỹ thuật nhân bản vô tính và đã có những thành công đáng khích lệ.
Mặc dù demecolcine hay colcemid là một hóa chất hỗ trợ rất tốt để xử lí loại nhân tế bào động vật trên thế giới, nhưng tại Việt Nam, việc sử dụng hóa chất hỗ trợ demecolcine để loại nhân chưa được đề cập nhiều. Nhằm góp một phần nhỏ bé của mình vào những nghiên cứu nhân bản vô tính ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của chế độ xử lí demecolcine lên kết quả loại nhân tế bào trứng lợn phục vụ cho nhân bản vô tính”.Với mục tiêu nâng cao hiệu quả tạo tế bào trứng lợn đã được loại nhân thông

Kết quả khảo sát nâng cao hiệu quả thu và nuôi thành thục tế bào trứng lợn in vitro
Kết quả khảo sát nồng độ demecolcine và thời gian thích hợp để xử lí
tế bào trứng lợn
Kết quả khảo sát thời điểm thích hợp để xử lí demecolcine với tế bào trứng lợn đạt hiệu quả cao.
Kết quả so sánh hiệu quả loại nhân bằng phương pháp ép - đẩy và
phương pháp xử lí demecolcine kết hợp với hút nhân.
Sử dụng cytochalasin B kết hợp với demecolcine để nâng cao hiệu quả loại nhân