Báo Cáo Khai thác và phát triển nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm

VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ


MỤC LỤC
KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT . 3
1. TỔNG QUAN . 4
1.1. CƠ SỞ PHÁP LÝ/ XUẤT XỨ CỦA ĐỀ TÀI . 4
1.2. TÍNH CẤP THIẾT VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI . 4
1.3. ĐỐI TƯỢNG/PHẠM VI VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 4
1.4. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC . 5
1.4.1. Axit phytic . 5
1.4.2. Enzyme phân giải phytate (phytase) 6
1.4.2.1. Nguồn phytase 7
1.4.2.2. Đặc điểm phytase . 9
1.4.2.3. Ứng dụng của phytase 12
1.4.3. Nghiên cứu chuyển gene mã hóa phytase . 15
1.4.3.1. Gene mã hoá phytase 15
1.4.3.2. Một số thành tựu chuyển gene mã hóa phytase 16
1.4.4. Hệ biểu hiện . 20
1.4.4.1. Các hệ biểu hiện phổ biến . 20
1.4.4.2. Đặc điểm của hệ biểu hiện P. pastoris . 21
1.4.4.3. Cấu trúc vector biểu hiện ở P. pastoris 22
1.4.4.4. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastoris 24


2. THỰC NGHIỆM . 26


2.1. NGUYÊN LIỆU . 262.1.1. Chủng vi sinh vật . 26
2.1.2. Plasmid 26
2.1.3. Hoá chất . 26
2.1.4. Môi trường nuôi cấy và dung dịch đệm . 27
2.1.4.1. Môi trường nuôi cấy . 27
2.1.4.2. Dung dịch đệm . 27
2.1.5. Thiết bị . 28
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.2.1. Tách chiết ADN . 28
2.2.1.1. Tách chiết ADN genome của Aspergillus và Pichia 28
2.2.1.2. Tách chiết plasmid 28
2.2.2. PCR 29
2.2.3. Xác định trình tự gene . 30
2.2.4. Ghép nối plasmid . 30
2.2.5. Biến nạp ADN . 30
2.2.5.1. Biến nạp vào E. coli bằng sốc nhiệt . 30
2.2.5.2. Biến nạp P. pastoris bằng xung điện 31
2.2.6. Tuyển chọn dòng mang gene biến nạp 32
2.2.7. Biểu hiện gene trên P. pastoris 32
2.2.8. Xác định hoạt tính phytase 32
2.2.9. Phương pháp xác định protein tổng số (Bradford) 35
2.3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN . 36
2.3.1. Thiết kế vector thể hiện phyA không chứa đuôi His-tag và C-myc-epitope (phyAs) . 38
2.3.1.1.Thiết kế mồi. 38
2.3.1.2. Nhân dòng gene 39
2.3.1.3. Tinh sạch sản phẩm PCR . 39
2.3.1.4. Gắn phyAs vào vector biểu hiện pPICZαA . 40
2.3.1.5. Kiểm tra sự có mặt của phyAs có trong E. coli bằng PCR colony . 42
2.3.1.6. Tách chiết phasmid 43
2.3.2. Kiểm tra trình tự của thiết kế mới tại các vị trí liên kết 44
2.3.3. Chuyển vector biểu hiện pPICZαA/phyAs vào P. pastoris 45
2.3.3.1. Mở vòng pPICZαA/phyAs 45
2.3.3.2. Biến nạp vector biểu hiện pPICZαA/phyAs/Pme I vào P. pastoris . 46
2.3.4. Biểu hiện phyAs trên P. pastoris . 48
2.3.5. Tuyển chọn chủng biến nạp có hoạt tính phytase cao . 51
2.3.6. Tuyển chọn chủng biến nạp mang multicopy 52
2.3.7. Xác định điều kiện lên men và thu hồi phytase . 55
2.3.7.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ methanol . 55
2.3.7.2. Ảnh hưởng của các môi trường và thời gian nuôi cấy đến khả năng biểu hiện phytase 56
2.3.8. Nghiên cứu so sánh đặc tính của phytase tái tổ hợp 59
3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 64
3.1. KẾT LUẬN 64
3.2. KIẾN NGHỊ 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 65
PHỤ LỤC 72




1. TỔNG QUAN
1.1. CƠ SỞ PHÁP LÝ/ XUẤT XỨ CỦA ĐỀ TÀI
Đề tài được thực hiện theo hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ với mã số: 07.08.QG/HĐ-KHCN giữa Bộ Công nghiệp và Viện Công nghiệp Thực phẩm ký ngày 20/02/2008 (bản photo hợp đồng trang cuối). Trong quá trình thực hiện đề tài còn nhận được sự hỗ trợ bổ sung từ SIDA/SAREC thông qua dự án “Nghiên cứu sử dụng phế thải nông nghiệp để sản xuất enzyme vi sinh vật cho chăn nuôi gia súc, gia cầm ở Việt Nam” do TS. Mai Thị Hằng (Đại học Sư phạm Hà Nội) làm chủ nhiệm.


1.2. TÍNH CẤP THIẾT VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
Phytase là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng trong thực tiễn. Trong chăn nuôi, bổ sung phytase riêng hoặc cùng với các enzyme khác đều làm tăng trọng lượng vật nuôi. Phytase một mặt có tác dụng làm giảm tác động kháng dinh dưỡng của axit phytic, làm giảm chi phí khẩu phần vì không cần thiết bổ sung phốt pho vô cơ vào trong thức ăn; mặt khác làm giảm lượng phốt pho dư thừa thải qua phân, góp phần quan trọng vào ngành chăn nuôi sạch và bền vững [Simell và CS., 1989]. Ngoài những ứng dụng quan trọng trong chăn nuôi, phytase bắt đầu được sử dụng trong thực phẩm của người, điều chế các dẫn xuất myo-inositol phosphate cho ngành dược phẩm,
sử dụng trong công nghiệp giấy, ứng dụng cải tạo đất trồng [Ashima, 2000].


Trên thế giới, đã có rất nhiều nghiên cứu phytase của vi sinh vật, từ mức sơ bộ tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính đến mức phân tử nhân dòng, giải trình tự, biểu hiện gene, cung cấp chủng giống tái tổ hợp cho sản xuất ở qui mô công nghiệp. Việt Nam sở hữu một
nguồn gene vi sinh vật phong phú nhưng chưa được khai thác một cách có hiệu quả. Một trong những lý do là vi sinh vật phân lập từ môi trường nếu không qua chọn lọc, cải tạo sẽ khó có thể ứng dụng được trong sản xuất công nghiệp. Những nghiên cứu về phytase ở
Việt Nam chỉ mới trong giai đoạn bắt đầu.


1.3. ĐỐI TƯỢNG/PHẠM VI VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Đề tài được thực hiện với nội dung chính là tách dòng gene mã hóa phytase từ vi sinh vật đang bảo tồn lưu giữ nhằm cung cấp nguyên liệu di truyền cho việc tạo các chủng sinh phytase tái tổ hợp phục vụ sản xuất. Đề tài bao gồm những phần công việc chính như sau:
- Thiết kế vector thể hiện phyA không chứa đuôi His-tag và c-myc-epitope
- Kiểm tra trình tự của thiết kế mới tại các vị trí liên kết
- Biến nạp đa bản phyA vào P. pastoris
- Thể hiện phyA trên P. pastoris
- Xác định điều kiện lên men và thu hồi phytase.