Luận Văn Khả năng biểu hiện gene etx mã hóa độc tố Epsilon của vi khuẩn Clostridium perfringenstype D trên độ

Đồ án tốt nghiệp năm 2011
Đề tài: Khả năng biểu hiện gene etx mã hóa độc tố Epsilon của vi khuẩn Clostridium perfringenstype D trên động vật thí nghiệm


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN . i
MỤC LỤC . ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC HÌNH vi
DANH MỤC BẢNG vii
DANH MỤC BẢNG vii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1. 1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC . 3
1.1.1. Nước ngoài 3
1.1.2. Trong nước 5
1.2. ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN C. perfringens 5
1.2.1. Phân loại . 5
1.2.2. Đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu. . 6
1.2.3. Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa . 7
1.2.4. Đặc tính di truyền. 9
1.2.5. Sức đề kháng của C. perfringens 9
1.2.6. Các type độc tố (toxinotype) và khả năng gâybệnh . 10
1.2.6.1. Type A 11
1.2.6.2. Type B . 12
1.2.6.3. Type C . 12
1.2.6.4. Type D 13
1.2.6.5. Type E . 14
1.3. MỘT SỐ ĐỘC TỐ CHÍNH CỦA C. perfringens [18] . 14
1.3.1. Alpha toxin (CPA) 14
1.3.2. Beta toxin (CPB) . 15
1.3.3. Epsilon toxin (ETX) . 15
iii
1.3.4. Iota toxin (CPI) . 16
1.3.5. Enterotoxin (CPE) 16
1.3.6. Delta toxin . 16
1.3.7. Theta toxin 17
1.4. HIỂU BIẾT VỀ ĐỘC TỐ EPSILON (ETX) CỦA C. perfringens . 17
1.4.1. Tính chất vật lý và tính chất hóa học của ETX 17
1.4.2. Gen mã hóa ETX 17
1.4.3. Độc lực độc tố epsilon và phương pháp xác định 18
1.4.4. Cơ chế gây bệnh của độc tố epsilon (ETX) 19
1.5. MỘT SỐ LOẠI BỆNH DO VI KHUẨN C. perfringens GÂY RA
TRÊN DÊ, CỪU . 20
1.5.1. Bệnh viêm ruột nhiễm độc huyết trên dê, cừu. . 20
1.5.2. Bệnh viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừu do C. perfringensgây ra 21
1.6. ENZYME TRYPSIN . 22
1.7. PHƯƠNG PHÁP PCR 23
1.7.1. Nguyên tắc của phương pháp PCR . 23
1.7.2. Thực nghiệm . 24
1.7.3. Các tác nhân ảnh hưởng đến phản ứng PCR 25
1.7.4. Phương pháp phân tích kết quả PCR 27
CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
. 29
2.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
29
2.3. VẬT LIỆU, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
29
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 29
2.4.1. Giám định một số đặc tính sinh học, hóa học của vi khuẩn C.
perfringenstheo phương pháp của Quinn P.J. và cộng sự (1994) [34].
. 29
2.4.2. Xác định gen mã hóa độc tố epsilon bằng phảnứng PCR . 31
iv
2.4.3. Kiểm tra khả năng biểu hiện gene mã hóa độc tố epsilon trên động
vật thí nghiệm . 34
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
. 35
CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 36
3.1. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦAVI
KHUẨN C. Perfringens . 36
3.1.1. Kết quả kiểm tra hình thái của vi khuẩn C . perfringens
36
3.1.2. Kết quả kiểm tra khả năng di động bằng phương pháp soi tươi
. 36
3.1.3. Đặc tính nuôi cấy
37
3.1.4. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. perfringens
38
3.2. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ ETX BẰNG
PHƯƠNG PHÁP PCR . 41
3.3. KẾT QUẢ KIỂM TRA BIỂU HIỆN CỦA EPSILON TOXIN TRÊN
ĐỘNG VẬT THÍ NGIỆM . 42
3.3.1. Kết quả kiểm tra biểu hiện của epsilon toxintrên chuột nhắt trắng . 42
3.3.2. Kết quả kiểm tra biểu hiện của độc tố epsilon toxin trên dê 44
CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 46
4.1. KẾT LUẬN . 46
4.2. ĐỀ NGHỊ . 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47


ĐẶT VẤN ĐỀ
Clostridium perfringeneslà một vi khuẩn yếm khí, gram dương, có khả
năng sinh bào tử thường được tìm thấy trong tự nhiên (trong đất, nước, và đường
tiêu hóa của nhiều loài động vật). Nó được coi là một trong những vi khuẩn chủ
yếu gây ra nhiều bệnh cho người và nhiều loài gia súc, gia cầm khác nhau.
Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn C. perfringenssản sinh hơn 17 loại độc
tố khác nhau như: Độc tố Alpha (α), Beta (β), Epsilon (ε), Iota (i), Beta2,
Enterotoxin, Theta, vv Dựa vào khả năng sản sinh 4 loại độc tố chính (alpha, beta,
epsilon, iota) người ta phân chia vi khuẩn C. perfringensthành 5 type độc tố
(toxinotype) khác nhau (A, B, C, D, E). Các type khác nhau thường gây ra các thể
bệnh khác nhau cho người và động vật. Trong số các loại độc tố do C. perfringenes
sản sinh, độc tố epsilon toxin (ETX) được tạo ra bởi vi khuẩn C. perfringenstype B
và type D có độc lực mạnh nhất. Các kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy C.
perfringenstype D đóng vai trò quan trọng trong bệnh viêm ruột hoại tử dê, cừu ở
Việt Nam [3,4]. Độc tính của độc tố epsilon, chỉ xếp sau độc tố botulinum và
tetanus, được trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh của Mỹ liệt vào nhóm
chất khủng bố sinh học.
Độc tố epsilon được mã hóa bởi gene Etx, gene này nằm trên plasmid của vi
khuẩn C. perfringens, tiết ra trong đường ruột dưới dạng tiền độc tố (prototoxin),
trọng lượng phân tử khoảng 34,25 kDa, sau đó được hoạt hóa bởi enzyme protease
như trypsin. Trypsin sẽ cắt đứt liên kết peptid giữa axit amin thứ 14 và 15 (Lys – 14
– Ala – 15) tính từ đầu N của chuỗi peptid, giải phóng một đoạn peptid gồm 14 axit
amin, hoạt hóa cho ETX hoạt động. Độc tố epsilon tác dụng lên nhóm lipid:
Cholesterol và sphingolipid có mặt trên màng tế bàođộng vật có xương sống, vì vậy
độc tố này tập trung ở não và thận của con bệnh. Độc tố epsilon được hấp thụ thông
qua dịch nhầy của ruột vào máu đi khắp cơ thể và đến các cơ quan bên trong. Tại
đây độc tố làm tăng áp lực thành mạch, gây phá hủy màng trong của mạch máu, làm
tăng tính thấm thành mạch và tích dịch trong các xoang của cơ thể, gây phù một số
cơ quan, đặc biệt là não, tim, phổi, gan và thận [18]. Khi tác động vào con vật, độc
tố sẽ gây tổn thương não, làm rối loạn các chức năng thần kinh bình thường, con vật
sẽ bị mù, la hét, mất phương hướng và không có khả năng ăn uống Thận cũng sẽ
2
bị phân giải, xuất huyết, kèm theo một loạt các triệu chứng thông thường khác như:
tiêu chảy, phân có lẫn máu và niêm mạc, đặc biệt cómùi thối khắm, co giật toàn
thân, nghiến răng và cuối cùng là dẫn đến chết nếu không được chữa trị kịp thời.
Để tìm hiểu về độc tính và tác động gây bệnh của độc tố epsilon do C.
perfringens type D tiết ra, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Khả năng biểu
hiện gene etxmã hóa độc tố Epsilon của vi khuẩn Clostridium perfringenstype
D trên động vật thí nghiệm ” .
Nội dung của đề tài:
1. Kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của 10 chủngC.
perfringens type D phân lập từ dê mắc bệnh viêm ruột hoại tử.
2. Giámđịnh gene Etx mã hóa độc tố epsilon bằng kỹ thuật PCR .
3. Nghiên cứu khả năng biểu hiện gene Etx mã hóa độc tố epsilon
trên động vật thí nghiệm.
Mục tiêu của đề tài:
Góp phần cung cấp những thông tin về độc tố epsiloncủa chủng C.
perfringens đang tồn tại và gây bệnh viêm ruột hoại tử ở dê trong những năm gần
đây. Giúp đề xuất biện pháp phòng trị bệnh có hiệu quả, để giảm thiểu tối đa
những thiệt hại do độc tố epsilon vi khuẩn C. perfringensgây ra.
3
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. 1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
1.1.1. Nước ngoài
Vào năm 1892 tại phòng thí nghiệm trường đại học Johns Hopkins ở
Baltimore, lần đầu tiên vi khuẩn C. perfringensđược phát hiện và đặt tên là
Bacillus aerogenes capsulatusbởi William Welch và George Nuttall, sau đó
được đổi thành Bacillus welchii, và đến nay được gọi là C. perfringens [18].
C. perfringenslà trực khuẩn yếm khí, gram dương, có khả năng sinh bào
tử, thường tìm thấy trong tự nhiên (trong đất, nước, và ống tiêu hóa của nhiều
loài động vật). Nó được coi là một trong những vi khuẩn độc nhất được biết đến,
nó là tác nhân gây ra nhiều thể bệnh khác nhau không chỉ nguy hiểm cho nhiều
loài gia súc, gia cầm mà còn nguy hiểm đến con người. Hiện nay đã có rất nhiều
công trình nghiên cứu trong và ngoài nước nghiên cứu về vi khuẩn C.
perfringensở nhiều lĩnh vực khác nhau.
Theo Field và cộng sự (1955) thuộc trường Đại học Cambridge, từ những
năm 50 vi khuẩn C. perfringens (lúc đó có tên gọi Clostridium wellchii) đã gây
bệnh viêm ruột nhiễm độc huyết – enterotoxaemia (NĐRH) đối với động vật
nuôi như bê sơ sinh (Griner & Bracken, 1953), cừu non (Griner & Jonhson,
1954) và có thể gây chết heo con (Field & Gibson, 1955). Bệnh viêm ruột nhiễm
độc huyết phát triển làm xuất hiện trong ruột nhữngđốm nhỏ viêm xuất huyết [16].
Niilo L. và Chalmers G. A. (1982) đã phát hiện bệnhNĐRH ở ngựa con 4
ngày tuổi tại Alberta, Canada. Bệnh này làm ngựa con chết, mổ khám phát hiện
ruột có nhiều điểm nhỏ xuất huyết và viêm hoại tử. Cũng tại miền Nam Alberta
vào năm 1973, lần đầu tiên phát hiện C. perfringens type D trên bê [29, 30].
Niilo L. (1986) cho biết đã phân lập được C. perfringens type C, type D từ
tá tràng của cừu trưởng thành 8-9 tháng tuổi, cừu thường chết vì bị xuất huyết
ruột với những điểm hoại tử [31].
Năm 1998, Miserez và cộng sự tiến hành định type vi khuẩn C. perfringens
trên dê, cừu với 52 mẫu bệnh phẩm biểu hiện triệu chứng của bệnh viêm ruột
hoại tử và 13 mẫu dê, cừu khỏe mạnh. Kết quả cho thấy tất cả 52 mẫu bệnh phẩm


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ Thủy sản (2004) – Dự án cải thiện chất lượng và xuất khẩu thủy sản
(SEAQIP), Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản, NXB Nông
nghiệp Hà Nội.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục.
3. Nguyễn Bá Hiên (1999). Kết quả xác định số lượng và sự biến động của
trực khuẩn yếm khí Clostridium perfringens trong phân gia súc khỏe và
mắc hội chứng tiêu chảy.Kết quả nghiên cứu KHKT Khoa Chăn nuôi thú
y. 1996-1998. Nxb. Nông nghiệp Hà Nội.
4. Lê Lập, Nguyễn Đức Tân và cộng sự (2007). Phân lập và xác định type độc
tố (Toxinotype) của vi khuẩn Clostridium perfringens ở động vật nhai lại
bằng kỹ thuật Multiplex PCR. Tạp chí NN & PTNN-kì 1, tháng 5/2007.
5. Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Đỗ Ngọc Thúy và Nguyễn Bá Hiên (2009). Một số đặc
tính sinh học của vi khuẩn clostridium perfringens phân lập từ bò và lợn
mắc hội chứng tiêu chảy tại Hà Nội và vùng phụ cận.Khoa học Kỹ thuật
Thú y, Tập XVI, Số 4/2009.
6. Nguyễn Hoàng Lộc và cộng sự (2007). Giáo trình sinh học phân tử. Đại
học Huế.
7. Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê thị Thủy Tiên,
Tạ Thu Hiền (2004). Công Nghệ Enzyme. NXB Đại Học Quốc Gia TP. Hồ
Chí Minh.
8. Đỗ Văn Ninh (2010). Bài giảng độc chất học. NXB Đại Học Nha Trang .
9. Phạm Hồng Sơn (2002). Vi sinh vật thú y.NXB Nông nghiệp HN.
10. Nguyễn Văn Sửu, Nguyễn Quang Tuyên (2003). Biến động số lượng vi
khuẩn trong phân bê nghé bị tiêu chảy ở một số tỉnhmiền núi phía Bắc.
Tạp chí KHKT Thú y, tập X, số 4, trang 38 - 42.
11. Lê Văn Tạo và cộng sự (2002). Phân lập các chủng vi khuẩn yếm khí C.
perfringens từ trâu, bò chết đột ngột tại các tỉnh phía Bắc, thử độc lực
trên động vật thí nghiệm.Tạp chí KHKT Thú y, tập IX, số 4/2002.
12. Nguyễn Quang Tính, (2007). Xác định vai trò gây bệnh đường tiêu hóa
của vi khuẩn Clostridium perfringens ở trâu, bò, dêtại tỉnh Thái Nguyên
48
và biện pháp phòng trị. Luận án tíến sỹ Nông nghiệp, Viện thú y. Hà nội,
2007.
Tài liệu tiếng Anh
13. Bosworth T. J., (1943). On a new type of toxin produced by Clostridium
welchii.J Comp Pathol.;53:245–255.
14. Buxton. D., & Morgan. K. T., (1976). Studies of lesions produced in the
brains of colostrum deprived lambs by Clostridium welchii (Cl.
perfringens) type D toxin. J Comp Pathol 86: 435-447.
15. Fernandez-miyakawa et al., (2007). C. perfringens type D oral challenge
mouse model.Infection and Immunity: 4282-4288.
16. Field H.I., and Gibson E.A., (1955). C. perfringens (CL. Welchili)
enteratoxaemia in the ruminant.Vet. rec., 31-67.
17. Finnie J. W., (2003). Pathogenesis of brain damage produced in sheep by
Clostridium perfringens type D epsilon toxin: a review. Aust. Vet J. 81:
219-221.
18. Hatheway C.L., (1990). Toxigenic clostridia. Clin. Microb.
19. Havard H. L., Hunter. S. E., & Titball R. W.,(1992). Comparison of the
nucleotide sequence and development of a PCR test for the epsilon toxin
gene of Clostridium perfringens type B and type D.FEMS Microbiol Lett
76:77-81.
20. Huebner K.D., M.D. Facep., Robert W. Wannemacher.,(2007).
Additional Toxins of Clinical Concern. In Medical aspects of biological
warfare.Borden Institute. Washington, DC.
21. Johansson A., (2006). Clostridium perfringens the causal agent of
necrotic enteritis in poultry.
22. Malone F., P.J. Mcparland., & J.O’hagan.,(2004). Causes of mortality in
an intensive lamb fattening unit .Irish Veterinary Journal.
23. Mancini G., Carbonara A. O., & Heremans J. F., (1965).
Immunochemical quantitation of antigens by single radial
immunodiffusion.Immunochemistry. 2:235-254.
49
24. Manteca C., Daube G., Jauniaux T., Linden A ., Pirson V., Detilleux J.,
Ginter A., Coppe P., Kaeckenbeeck A., Mainil J.G., (2002): A role for
the Clostridium perfringens β2 toxin in bovine enterotoxaemia.
25. McDonel J. L., (1980). Clostridium perfringens toxins (type A, B, C, D,
E). Pharmacol. Ther. 10: 617-655.
26. Miserez R., J. Frey., C. Buogo., S.Capaul., A.Tontis., A.Byrnens., and
J.Nicolet., (1998). Detection of α- and ε- toxigenic C. perfringens type D
in sheep and goats using a DNA amplification technique (PCR). Letters
in Applied Microbiology 1998, 26: 382-386.
27. Miyashiro S., Nassar A. F. C., Delfava C., Cabral A. D., Silva M.,
(2007). Clostridium perfringens type A and D associated with
enterotoxima in an 18-month-old goat. J. Venom. Anim. Toxins incl.
Trop. Dis., 2007, 13, 2, p. 886.
28. Nagahama M., & Sakurai J., (1992). High-affinity binding of
Clostridium perfringens epsilon-toxin to rat brain.Infect Immun. 60:
1237-1240 .
29. Niilo L., Harries WN., Jones G.A., (1974).Clostridium perfringens type
C in hemorrhagic enterrotoxemia of neonatal calves in Alberta. Can Vet
J. 1974 Aug;15(8):224–226.
30. Niilo, L.,Chalmers, G.A., (1982). Hemorrhagic enterotoxemia caused
by Clostridium perfringens type C in a foal. Can. Vet. J. 23:299-301.
31. Niilo L., (1986). Experimental production of hemorrhagic
enterotoxaemia by Clostridium perfringens type C inmaturing lambs.
Can. Vet. Res 50: 32-35.
32. Payne D., & Oyston P., (1997). The Clostridium perfringens epsilon
toxin. In The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis.
Academic Press, 439-447.
33. Payne D. W., Williamson E. D., Havard H., Modi N.,& Brown
J.,(1994). Evaluation of a new cytotoxicity assay for Clostridium
perfringens type D epsilon toxin. FEMS Microbiol Lett 116:161-167.
50
34. Quinn P.J., M.E. Carter., B. Markey., G.R. Carter., (1994).
Clostridium species. Clinal Verternary Microbiology. Wolfe
Publishing, 191-208 .
35. Sayeed S., J. Li., and B. A. McClane., (2007). Virulence Plasmid
Diversity in Clostridium perfringens Type D Isolates.Infect. Immun.
75:2391-2398.
36. Sipos W.; Fischer L.; Schindler M.; Schmoll F., (2003). Genotyping of
Clostridium perfringens isolated from domestic and exotic ruminants and
swine.J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health. 2003 Se p;50(7):360-2.
37. Smith L.D., & Williams B.L., (1984). The Pathogenic Anaerobic
Bacteria. 3rd edn.C.Thomas, Springfield, IL .
38. Songer J.G., and Dawn Bueschel., (1999). Multiplex PCR Procedure
for Genotypeing Clostridium perfringens.Dep. of Veterinary Science,
University of Arizona, Tucson. Dec16.
39. Uzal F.A., W.R. Kelly., W.E.Morris., and R. A. Assis., ( 2002): Effects
of intravenous injiection of Clostridium perfringens type D epsilon toxin
in calves.J. comp. Pathol. 126:71-5.
40. Wen Q., và Bruce A , McClalane., (2004). Detection of
Enterotoxingenic Clostridium perfringens Type A Isolates in American.
Retail Foods.
41. Worthington R.W., Mulders M. S., & Van Rensburg J.J., (1973).
Enzymatic activation of Clostridium perfringens epsilon prototoxin and
some biological properties of activated toxin.Onderstepoort J Vet Res
40:151-154 .
Một số trang web đã nghiên cứu
42. http://agriviet.com/news_
43. sinhhocvietnam.com.vn
44. www. wikipedia.org