Thạc Sĩ Hoàn thiện quy trình tinh chế kháng thể đơn dòng và sản xuất cộng hợp 6b6c gắn enzyme hrp dùng trong

ĐẶT VẤN ĐỀ
Virus Dengue là một virus thuộc nhóm Flavivirus, thuộc họ Flaviviridae. Họ virus này bao gồm hơn 70 loài hầu hết gây bệnh cho người và động vật. Các virus trong nhóm này phân bố phổ biến ở mọi nơi trên thế giới và gây các vụ dịch lớn nhỏ khác nhau ở những vùng khác nhau như virus viêm não Nhật Bản (JE) gây bệnh ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Sri LanKa; virus miền Tây sông Nil (West Nile) gây bệnh ở châu Phi, Trung Đông, châu Âu; virus Dengue xuất hiện ở khắp nơi trên thế giới.
Với tình hình du lịch, di dân ngày càng gia tăng thì bệnh do các virus này gây ra cũng ngày càng lan rộng và đe dọa nghiêm trọng vấn đề sức khỏe cộng đồng cũng như kinh tế của các quốc gia, trong đó có nước ta.
Ở Việt Nam, hai loại virus trong nhóm Flavivirus gây bệnh chủ yếu hàng năm là Dengue và JE. Trong đó, virus Dengue lưu hành chủ yếu ở miền Nam Việt Nam và gây ra bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue (SD/SXHD) có thể dẫn đến sốc Dengue với tỷ lệ tử vong cao và gây thiệt hại lớn về nhiều mặt.
Hiện nay chưa có vaccine đặc hiệu cũng như thuốc điều trị bệnh Dengue. Vì vậy, việc kiểm soát vector gây bệnh cũng như chẩn đoán sớm bệnh là vô cùng quan trọng để giảm thiệt hại do virus này gây ra. Có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh Dengue như phân lập virus, PCR xác định bộ gene virus, chẩn đoán huyết thanh học (bao gồm vi trung hòa, ức chế ngưng kết hồng cầu, ). Tuy nhiên, nếu xét về thời gian xét nghiệm, giá cả và độ chính xác thì phản ứng MAC–ELISA vẫn là phương pháp hiệu quả nhất trong công tác chẩn đoán cũng như giám sát và nghiên cứu dịch tễ học bệnh SD/SXHD tại những quốc gia lưu hành dịch cao như nước ta
Phòng thí nghiệm Arbovirus–viện Pasteur tP.HCM hiện đang sử dụng bộ sinh phẩm (kít) MAC–ELISA trong chẩn đoán huyết thanh học và nghiên cứu dịch tễ học bệnh nhiễm virus Dengue tại viện, đồng thời cung cấp bộ kít này cho các trung tâm y tế dự phòng và bệnh viện các tỉnh phía Nam nhằm hỗ trợ cho công tác điều trị và giám sát huyết thanh học dịch bệnh Dengue trong khuôn khổ Chương trình y tế quốc gia về phòng chống bệnh SXHD. Với nhu cầu sử dụng ngày càng nhiều, việc chủ động sản xuất sinh phẩm cho bộ kít MAC–ELISA sản xuất trong nước này là vô cùng quan trọng. Trong đó, cộng hợp IgG kháng nhóm flavivirus đánh dấu enzyme HRPO là ưu tiên hàng đầu vì cộng hợp này trước đây được cung cấp bởi Trung tâm Kiểm soát bệnh tật (CDC)
Hoa Kỳ trong các dự án hợp tác với viện Pasteur Tp.HCM, sau đó phòng xét nghiệm Arbovirus đã tích cực nghiên cứu và xây dựng quy trình sản xuất cộng hợp này tại chỗ nhưng hiệu giá sinh phẩm còn hạn chế. Vì thế, đề tài nghiên cứu “HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TINH CHẾ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG VÀ SẢN XUẤT CỘNG HỢP 6B6C GẮN ENZYME HRPO DÙNG TRONG BỘ KIT MAC– ELISA XÉT NGHIỆM SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE” đã được tiến hành nhằm các mục đích sau:
- Cải tiến quy trình tinh chế kháng thể đơn dòng kháng nhóm Flavivirus từ dịch nuôi cấy tế bào hybridoma SLE 6B6C.
- Tạo cộng hợp IgGkháng nhóm flavivirus gắn –HRPO có hiệu giá và độ nhạy cao sử dụng trong bộ kít MAC – ELISA chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue
MỤC LỤC
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN . i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . iii
DANH SÁCH HÌNH ẢNH iv
DANH MỤC CÁC BẢNG .vi
DANH MỤC ĐỒ THỊ vii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương I 3
TỔNG QUAN .3
1.1) VIRUS DENGUE 3
1.1.1) CẤU TRÚC PHÂN TỬ 5
1.1.2) CƠ CHẾ SAO CHÉP VÀ NHÂN LÊN CỦA VIRUS DENGUE 7
1.1.3) SỐT DENGUE/SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE 8
1.1.4) CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN BỆNH DENGUE .17
1.2) CÔNG NGHỆ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG [9] 22
1.2.1) KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG VÀ KHÁNG THỂ ĐA DÒNG 23
1.2.2)TẾ BÀO HYBRIDOMA [9], [18] 24
1.2.3) CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG .29
1.3) PHƯƠNG PHÁP GẮN ENZYME HRP VỚI IGG [12], [18], [23], [24] 32
1.3.1) HRP .32
1.3.2) PHƯƠNG PHÁP GẮN HRPO VỚI IGG .33
Chương II .35
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35
2.1) VẬT LIỆU 35
2.1.1) DỤNG CỤ VÀ TRANG THIẾT BỊ. .35
2.1.2) HÓA CHẤT: 36
2.1.3) VẬT LIỆU SINH HỌC. .39
2.2) QUY TRÌNH THỰC HIỆN 39
2.3) PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM .41
2.3.1) PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO 41
2.3.2) PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG [7], [12], [13], [14]. 44
2.3.3) PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI SDS–PAGE .46
2.3.4) PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP (IFA) 49
2.3.5) PHƯƠNG PHÁP GẮN IGG VỚI HRPO TẠO CỘNG HỢP 51
2.3.6) PHƯƠNG PHÁP MAC–ELISA .52
2.3.7) PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ ĐỘ TƯƠNG ĐỒNG .54
Chương III .56
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 56
3.1) KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO HYBRIDOMA 56
3.2) KẾT QUẢ TINH CHẾ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG .59
3.3) KẾT QUẢ TẠO CỘNG HỢP IGG-HRPO 65
3.4) KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CỘNG HỢP TRÊN MẪU DENGUE VÀ MẪU JE 69
3.4.1) ĐÁNH GIÁ CỘNG HỢP THU ĐƯỢC TRÊN MẪU HUYẾT THANH DENGUE .70
3.4.2) ĐÁNH GIÁ CỘNG HỢP TRÊN MẪU HUYẾT THANH JE 71
Chương IV 73
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 73