Luận Văn HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α

TÓM TẮT


BÙI THỊ THANH TỊNH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, “Hoàn thiện


quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α”, được thưc hiện


tại Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh và Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật-Trường


Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.


Giáo viên hướng dẫn: thầy Lê Đình Đôn.


Đề tài được thực hiện từ tháng 02 năm 2006 đến tháng 08 năm 2006 với các nội


dung:


Hoàn thiện phương pháp chuẩn bị tế bào khả nạp theo phương pháp sử dụng


hoá chất.


Hoàn thiện quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α


Hoàn thiện quy trình chiết tách plasmid, phản ứng cắt plasmid để kiểm tra.


Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho đoạn DNA từ phản ứng PCR và plasmid sau khi


cắt.


Thiết lập phản ứng chèn đoạn DNA vào plasmid pBluescript.


Kết quả thu được như sau:


Thiết lập được quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hoá chất, tế bào khả


nạp có thể giữ ở -70 C với glycerol trong thời gian 2 tháng.


Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli DH5α.


Chiết tách plasmid không lẫn tạp theo quy trình của Sambrook và cộng sự có


sửa đổi.


MỤC LỤC


Trang


Lời cảm ơn .i


Tóm tắt ii


Mục lục iii


Danh sách các chữ viết tắt vii


Danh sách các hình .vii


Danh sách các bảng .ix


PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1


1.1 Đặt vấn đề . 1


1.2 Mục tiêu của đề tài 2


1.3 Nội dung thực hiện .2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3


2.1 Hiện tương biến nạp ở vi khuẩn .3


2.1.1 Giới thiệu về hiện tượng biến nạp 3


2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tượng biến nạp 3


2.1.3 Cơ chế của hiện tượng biến nạp .5


2.1.4 Vai trò của hiện tượng biến nạp .5


2.1.5 Ứng dụng của hiện tượng biến nạp 5


2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp .6


2.2.1 Khái niệm chung các vector .6


2.2.2 Plasmid .7


2.2.2.1 Cấu trúc .7


2.2.2.2 Tính chất của plasmid 8


2.2.2.3 Phân loại plasmid 8


2.2.3 Phage 9


2.2.4 Chủng chủ E.coli 9


2.3 Các ezyme dùng trong biến nạp . 10


2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) . 11


2.3.1.1 Hiện tượng giới hạn . 11


2.3.1.2 Tên gọi các RE 11


2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn 12


2.3.1.4 Các RE loại II 12


2.3.2 Các enzym thông dụng khác 15


2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) 15


2.3.2.2 Taq polymerase . 15


2.3.2.3 Terminal transferase 15


2.3.2.4 Các DNase . 15


2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa . 16


2.3.3 Các enzym nối DNA 16


2.3.3.1 E.coli DNA ligase 16


2.3.3.2 T4 DNA ligase . 16


2.4 Các phương pháp sử dụng trong biến nạp 17


2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp . 17


2.4.1.1 Phương pháp hóa biến nạp 17


2.4.1.2 Phương pháp điện biến nạp . 18


2.4.2 Phương pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp . 18


2.4.3 Chiết tách DNA plasmid 19


2. 5 Điện di (Electrophoresis) . 19


2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nước và ngoài nước 20


2.6.1 Ngoài nước .20


2.6.2 Trong nước .21


PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22


3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp .22


3.2 Vật liệu nghiên cứu .22


3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α .22


3.2.2 pBluescript II SK(+/-) 22


3.2.3 Đoạn DNA .23


3.3 Dụng cụ và hóa chất .23


3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm 23


3.3.2 Các thiết bị máy móc .23


3.3.3 Các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn 23


3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm .24


3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm 24


3.4 Phương pháp nghiên cứu 25


3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn .25


3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn


E.coli DH5α và kiểm tra 26


3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E.coli DH5α trên môi trường LB .27


3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp .27


3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn


E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt


(theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) .27


3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra .29


3.4.6.1 Chiết tách plasmid .29


3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid


(quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) 32


3.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose .32


3.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR 33


3.4.7.1 Phương pháp tinh sạch DNA .33


3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel 33


3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX .34


3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR .35


3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn


DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) 36


3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α


khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) 37


PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38


4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 38


4.2 Tách chiết DNA plasmid 40


4.2.1 Tách chiết DNA plasmid .40


4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng AurumTM Plasmid Mini Kit .42


4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV .42


4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII 44


4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA 44


4.4.2 Tinh sạch plasmid 45


4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp 46


4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp .46


PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48


5.1 Kết luận .48


5.2 Kiến nghị 49