Luận Văn Hoàn thiện phƣơng pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây mắm đen ở khu dự trữ sinh quyển r

MỤC LỤC


Trang tựa


Lời cảm tạ .iii


Tóm tắt iv


Summary .v


Mục lục .vi


Danh sách các bảng ix


Danh sách các hình .x


Danh sách các chữ viết tắt xi


Chương 1: GIỚI THIỆU . 1


1.1. Đặt vấn đề 1


1.2. Mục đích, yêu cầu và giới hạn đề tài .2


1.2.1. Mục đích 2


1.2.2. Yêu cầu 2


1.2.3. Giới hạn đề tài .2


Chương 2: TỒNG QUAN TÀI LIỆU 3


2.1. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn . 3


2.1.1. Giới thiệu khu vực dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn 3


2.1.2. Vai Trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 4


2.2. Một số khái niệm về đa dạng sinh học 5


2.2.1. Đa dạng sinh học . 5


2.2.2 Sự đa dạng di truyền 5


2.2.3. Ý nghĩa của việc nghiên cứu và bảo vệ sự đa dạng di truyền . 6


2.3. Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây mắm đen . 6


2.3.1. Hình thái học . 6


2.3.2. Phân bố . 8


2.3.3. Vai trò của rừng mắm . 9


2.4. Các kỹ thuật trong tách chiết DNA . 9


2.4.1. Các thông tin di truyền 9


2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA . 10


2.4.3. Đánh giá chất lượng DNA . 11


2.4.3.1. Định lượng DNA bằng quang phổ kế 11


2.4.3.2.Định tính DNA bằng phương pháp điện di 12


2.5. PCR (polymerase chain reaction) 12


2.5.1. Nguyên tắc 12


2.5.2. Thành phần cơ bản của phản ứng PCR . 14


2.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới PCR 14


2.5.4. ưu điểm và nhược điểm 14


2.6. Một số chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng sinh học 15


2.6.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) . 15


2.6.2. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) . 16


2.6.3. Chỉ thị AFLP . 17


Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP .20


3.1. Nội dung đề tài 20


3.2. Thời gian thực hiện đề tài 20


3.3. Vật liệu 20


3.3.1. Mẫu mắm đen 20


3.3.2. Hóa chất thí nghiệm 21


3.3.2.1.Các hóa chất dùng trong ly trích DNA 21


3.3.2.2.Hóa chất dùng trong kiểm tra định lượng DNA .22


3.3.2.3.Hóa chất dùng trong định tính DNA .22


3.3.2.4.Hóa chất dùng để phản ứng RAPD .22


3.3.3. Trang thiết bị .22


3.4. Phương pháp . 23


3.4.1. Đối tượng nghiên cứu 23


3.4.2. Phương pháp nghiên cứu 23


3.4.3. Cách bố trí thí nghiệm 23


3.4.4. Phương pháp ly trích DNA 23


3.4.4.1.Quy trình ly trích mẫu tươi Doyle và Doyle (1988) 23


3.4.4.2.Quy trình ly trích DNA bằng nitơ lỏng .24


3.4.4.3.Định tính DNA bằng phương pháp điện di 25


3.4.4.4.Phương pháp định lượng DNA bằng quang phổ kế 25


3.4.5. Thực hiện phản ứng RAPD-PCR 26


3.4.5.1.Primer sử dụng 26


3.4.5.2.Bố trí thí nghiệm 26


3.4.6. Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYSpc . 30


Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32


4.1. Thu thập mẫu tại các tiểu khu rừng ngập mặn Cần Giờ 32


4.2. Bảo quản và ly trích vật liệu di truyền . 33


4.2.1. Bảo quản 33


4.2.2. Ly trích vật liệu di truyền 33


4.3. Kết quả phản ứng RAPD-PCR 37


Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45


5.1. Kết luận .45


5.2. Đề nghị 45


Chương 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO .47


DANH SÁCH CÁC BẢNG


Bảng 3.1. Thành phần hóa chất dung dịch ly trích EB 19


Bảng 3.2. Thành phần hóa chất TE 1X 19


Bảng 3.3. Danh sách các primer dùng trong nghiên cứu .23


Bảng 3.4. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 1 .24


Bảng 3.5. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 1 24


Bảng 3.6. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 2 25


Bảng 3.7. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 2 25


Bảng 3.8. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 3 .26


Bảng 3.9. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 3 26


Bảng 3.10.Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 4 .27


Bảng 3.11.Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 4 27


Bảng 4.1. Bảng OD của 6 mẫu nghiền theo qui trình cải tiến 34


DANH SÁCH CÁC HÌNH


Hình 2.1. Hình dáng cây mắm đen . 6


Hình 2.2. Lá và hoa của cây mắm đen 7


Hình 2.3. Trái của cây mắm đen . 7


Hình 2.4. Nguyên tắc hoạt động của phản ứng PCR 12


Hình 2.5. Nguyên tắc của kỹ thuật RFLP . 14


Hình 2.6. Nguyên tắc hoạt động của kỹ thuật RAPD . 15


Hình 4.1. Bản đồ vị trí lấy mẫu mắm đen ở Cần Giờ . 32


Hình 4.2. Ly trích DNA theo qui trình Doyle và Doyle (1988) . 33


Hình 4.3. Ly trích theo qui trình Doyle và Doyle (1988) cải tiến . 34


Hình 4.4. Ly trích DNA theo qui trình nitơ lỏng . 36


Hình 4.5. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPA10 và


OPA5 37


Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer RAH8 . 38


Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer 1 39


Hình 4.8. Kích thước band phản ứng RAPD-PCR của primer 1 39


Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPAC10 .40


Hình 4.10. Kết quả điện di sản phẩm của thí nghiệm 2 41


Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm của thí nghiệm 3 41


Hình 4.12. Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của mồi OPAC10 khi đã tối ưu 42


Hình 4.13. Cây phân nhóm di truyền của 11 mẫu mắm đen 43