Luận Văn Giám định loài và định type độc tố vi khuẩn Clostridium perfringens phân lập từ gà bằng kỹ thuật sin

Khóa luận tốt nghiệp năm 2011
Đề tài: Giám định loài và định type độc tố vi khuẩn Clostridium perfringens phân lập từ gà bằng kỹ thuật sinh học phân tử


MỤCLỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC . i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
LỜI NÓI ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tình hình nghiên c ứu vi khuẩn C. perfringens và bệnh vi êm ru ột hoại tử ở gà . 3
1.1.1. Trên thế giới . 3
1.1.2. Ở Việt Nam . 5
1.2. Vi khuẩn C. perfringens [10] . 5
1.2.1. Đặc điểm hình thái . 6
1.2.2. Đặc tính sinh vật hóa học . 7
1.2.3. Đặc tính di truyền . 8
1.2.4. Cơ chế gây bệnh của C. perfringens . 9
1.2.5. Phân loại các type độc tố của C. perfringens[14] . 9
1.3. Những hiểu biết về gene 16S RNA 13
1.3.1. Giới thiệu rRNA (RNA ribosome) 13
1.3.2. Cấu trúc và chức năng của 16S RNA 15
1.4. Phản ứng PCR [2], [9], [37], [38] . 16
1.4.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR . 17
1.4.2. Các điều kiện của phản ứng PCR 17
1.4.3. Các giai đoạn của phản ứng PCR 21
1.4.4. Các hạn chế của phản ứng PCR 22
1.5. Điện di -Phát hiện sản phẩm PCR [2], [9] . 25
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 27
2.1. Đối tượng nghiên cứu . 27
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 27
2.3. Vật liệunghiên cứu . 27
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm . 27
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội
ii
2.3.2. Hóa chất, môi trường và thuốc thử . 27
2.4. Phương pháp nghiên cứu 27
2.4.1. Phương pháp lấy mẫu . 27
2.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn C. perfringensbằng giám định đặc tính sinh
vật hóa học 28
2.4.3. Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của C. perfringens . 29
2.4.4. Xác định đặc tính hình thái của C. perfringens 30
2.4.5. Phương pháp giữ giống vi khuẩn 31
2.4.6. Giám định loài vi khuẩn C. perfringensđã phân lập theo phương pháp phát
hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR . 31
2.4.7. Phương pháp định type vi khuẩn C. perfringensbằng kỹ thuật Multiplex PCR
(Songer J.G. và cộng sự, 1999). . 34
2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu 36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens . 37
3.2. Kết quả kiểm tra đặc tính hình thái của C. perfringens 38
3.2. Kết quả kiểm tra đặc tính hình thái của C. perfringens 39
3.2.1. Hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn . 39
3.2.2. Kết quả kiểm tra khả năng di động của C. perfringens 40
3.3. Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của C. perfringens 40
3.4. Kết quả giám định loài vi khuẩn C. perfringensđã phân lập theo phương pháp phát
hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR . 45
3.5. Kết quả định type độc tố vi khuẩn C. perfringensphân lập được bằng kỹ thuật
Multiplex PCR 46
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN . 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 50
PHỤ LỤC . 54


LỜI NÓI ĐẦU
Vi khuẩn Clostridium perfringens (C. perfringens)phân bố rộng rãi trong
thiên nhiên, thường thấy trong đất, nước và chất thải. Vi khuẩn cũng thường cư trú
tự nhiên trong đường tiêu hóa của các loài gia súc, gia cầm như dê cừu, trâu bò,
heo, gà . Chúng là nguyên nhân gây nhiễm độc máu, viêm ruột tiêu chảy, hoại thư
sinh hơi và gây ngộ độc thực phẩm cho người.
C. perfringenslà nguyên nhân gây ra bệnh viêmruột hoại tử ở gà. Đây là loại
bệnh truyền nhiễm cấp tính, xảy ra đột ngột với tỷ lệ chết rất cao. Theo Ilenia Drigo
(2008), nguyên nhân gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà chủ yếu là do vi khuẩn C.
perfringenstype A và type C. Trong đó, độc tố alpha đóng vai trò chủ đạo [18].
Tuy nhiên, McDougald (2003) thì lại cho rằng bệnh viêm ruột hoại tử thường kế
phát từ bệnh cầu trùng. Theo ông, khi thời tiết hoặc khẩu phần ăn thay đổi đột ngột
sẽ làm giảm sức đề kháng của con vật, tạo điều kiện cho cầu trùng gây bệnh. Đây là
thời điểm tốt nhất để C. perfringenssinh sôi nẩy nở và sản sinh độc tố gây bệnh.
Thiệt hại do bệnh này gây ra cho các hộ gia đình và các trang trại chăn nuôi có thể
lên đến 5 -50 %.
Để xác định loài vi khuẩn C. perfringenstrong các mẫu thực phẩm hay mẫu
bệnh phẩm, người ta thường sử dụng phương pháp thường quy phân lập và giám
định các đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn (Quinn và cộng sự, 1994). Ưu điểm
của phương pháp này là tách được các chủng vi khuẩn thuần khiết nhưng lại tốn
nhiều thời gian và kết quả không thực sự chính xác do trong quá trình nuôi cấy một
số vi khuẩn có thể thay đổi đặc tính sinh hóa. Khoa học kỹ thuật mà đặc biệt là sinh
học phân tử ngày càng phát triển, các phương pháp thử nhanh (PCR, ELISA ) ra
đời giúp rút ngắn thời gian phát hiện, định lượng và định danh vi sinh vật với độ
chuẩn xác cao. Hiện nay, sử dụng phương pháp PCR trong việc giám định vi khuẩn
C. perfringensbằng phát hiện gene 16S RNA ngày càng ứng dụng rộng rãi. Gene
16S RNA là RNA đơn vị nhỏ (small unit) của ribosome vi khuẩn. Ở vi khuẩn,
ribosome được cấu tạo từ hai tiểu đơn vị ribonucleoprotein với hệ số lắng S lần lượt
là 50S và 30S. Tiểu đơn vị lớn 50S chứa hai loại RNA là 23S rRNA và 5S rRNA,
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội
2
tiểu đơn vị nhỏ 30S chỉ gồm một loại 16S rRNA. Gene 16S rRNA có một đặc điểm
rất đặc biệt, đó là chúng mang những vùng bảo tồn cao ở cấp độ nhóm xen kẽ với
những vùng biến động nhưng lại bảo tồn ở cấp độ loài, có trình tự rất bảo thủ không
thay đổi qua thời đại và rất chuyên biệt cho mỗi loại vi khuẩn. Chính vì vậy, gene
này đã trở thành “một thước đo tiến hóa”, là sự lựa chọn hàng đầu của các nhà khoa
học trong việc định danh và phân loại các vi khuẩn [7, 9, 20].
Từ những thực tế trên đây, được sự đồng ý của Lãnh đạo Phân viện Thú y
miền Trung và Ban giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường -Trường Đại
học Nha Trang, chúng tôi thực hiện đề tài: “Giám định loài và định type độc tố vi
khuẩn Clostridium perfringens phân lập từ gà bằng kỹ thuật sinh học phân tử”.
Mục tiêu của đề tài :
Phát hiện nhanh vi khuẩn C. perfringens, từ đó đề xuất biện pháp phòng trị
bệnh có hiệu quả cho gà và giúp giảm thiểu tối đa những thiệt hại do C. perfringens
gây ra.
Nội dung của đề tài:
1) Phân lập vi khuẩn Clostridium perfringens từ gà theo phương pháp thường
quy.
2) Giám định loài vi khuẩn Clostridium perfringens đã phân lập theo phương
pháp phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR.
3) Định type độc tố vi khuẩn Clostridium perfringens đã phân lập bằng kỹ
thuật Multiplex PCR.
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu
sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của quý thầy cô và các bạn để
báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn!
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C. perfringensvà b ệnh viêm ruột hoại tử ở gà
1.1.1. Trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về C.
perfringensgây bệnh cho người và các loại gia súc, gia cầm.
Theo Long J. R (1973), bệnh viêm ruột hoại tử (Necrotic Enteritis) do C.
perfringensgây ra ở gà được biết đến lần đầu tiên vào năm 1961 trên gà trống non
6 -7 tuần tuổi tại Anh, sau đó bệnh xuất hiện ở Úc, Canada, Mỹ và Thụy Điển.
Bệnh thường xảy ra trên gà từ 2 -4 tuần tuổi [23].
Hofshagen và cộng sự (1992), đã tiến hành phân lập vi khuẩn C. perfringens
từ 192 mẫu phân của 99 con gà thịt và 93 con gà rừng. Kết quả cho thấy, tỷ lệ phân
lập vi khuẩn C. perfringensvà khả năng sản sinh độc tố alpha ở gà thịt cao gấp 1,7
lần so với gà rừng [17].
Năm 2004, Hakan Kalender, Viện nghiên cứu và kiểm soát thú y, ElazÝÛ-
Thổ Nhĩ Kỳ, đã nghiên cứu phân lập vi khuẩn C. perfringenstừ manh tràng gà và
phát hiện gene mã hóa độc tố alpha do vi khuẩn này gây ra bằng phản ứng PCR.
Kết quả của nghiên cứu này là tác giả đã phân lập được vi khuẩn C. perfringenstừ
8 mẫu manhtràng gà trong số 160 mẫu đem phân tích (5%). Và trong 8 mẫu phân
lập được, sau khi tiến hành phản ứng PCR, có 6 mẫu mang gene độc tố type A và 2
mẫu còn lại không thể định type [16].
Effat và cộng sự (2007) đã phân lập vi khuẩn C. perfringenstừ các mẫu gà bị
bệnh tại các trang trại gà ở Cario -Ai Cập bị bệnh viêm ruột hoại tử. Ông đã định
type vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex PCR với 4 cặp mồi đặc hiệu
mã hóa cho 4 gene sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon, iota. Kết quả là type A với
độctố alpha là nguyên nhân gây bùng phát bệnh viêm ruột hoại tử ở các trang trại
này [15].
Cũng trong năm 2007, I. Svodosová và cộng sự, Đại học Brno -Cộng hòa Séc
đã phân lập 609 mẫu manh tràng của những con gà thịt từ 23 trang trại. Kết quả là
tác giả thuđược 112 mẫu dương tính với vi khuẩn C. perfringens(chiếm 18,39%).


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ thủysản (2004), Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản, Nhà xuất
bản Nông nghiệp Hà Nội.
2. Đào Trọng Đạt, Trần Thị Hạnh, Đặng Phương Kiệt (1998), Phân lập vi khuẩn C.
perfringens tại một số hộ gia đình của tỉnh Vĩnh Phú, Tạp chí thông tin Y dược
số 10, Bộ Y tế.
3. Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2007), Chú giải di truyền học, Nhà xuất bản
Giáo dục.
4. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003), Sinh học phân tử, Nhà xuất bản giáo dục, Trang
190 -199.
5. Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Đỗ Ngọc Thúy và Nguyễn Bá Hiên (2009), Một số đặc tính
sinh học của vi khuẩn Clostridium perfringens phân lập từ bò và lợn mắc hội
chứng tiêu chảy tại Hà Nội và vùng phụ cận, Khoa học kỹ thuật thú y, tập XVI,
số 4.
6. Lê Lập, Nguyễn Đức Tân (2006), Phân lập và xác định type độc tố (toxinotype)
của vi khuẩn Clostridium perfringens ở động vật nhai lại bằng kỹ thuật
Multiplex PCR, Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn 2007, số 9.
7. Phạm Hồng Sơn (2002), Vi sinh vật thú y, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
8. Trần Linh Thước (2004), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và mĩ phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục, Tp. Hồ Chí Minh.
9. Trần Thị Xô (chủ biên), Nguyễn Thị Lan (2000), Cơ sở di truyền và công nghệ
gen, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, Trang 157 -171.
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội
51
Tài liệu tiếng Anh
10. Anders Johansson. (2006), Clostridium perfringens the causal agent of necrotic
enteritis in poultry, Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science
Department of Biomedical Sciences and Veterinary Public Health Uppsala.
11. Annamari Heikinheimo. (2008), Diagnostic and molecular epidemiology of
cpe-positive C. perfringenstype A.
12. Anthony L. Keyburn và cộng sự. (2008), NetB, a New Toxin That Is Associated
with Avian Necrotic Enteritis Caused by Clostridium perfringens, 1913 -1927.
13. Cato, E., George, WL, and Fine gold, S. (1986), GenusClostridium, Beryey’s
Manual of systematic bacteriology 2: 1140 -1200.
14. Charles L. Hatheway. (1990), Toxigenic Clostridia, Clinical Microbiology
Reviews, Jan, pp. 66 -98.
15. Effat và cộng sự. (2007), Characterization of Clostridium perfringens
feildisolates, implicated in necrotic enteritis outbreaks on private broiler farms in
Cairo, by Multiplex PCR, African Journal of Microbiology Research , pp. 029 - 032.
16. Hakan Kalender. (2004), Isolation of Clostridium perfringensfrom Chickens
and Detection of the Alpha Toxin Gene by Polymerase Chain Reaction (PCR),
Veterinary control and research institute, 23100.
17. Hofshagen, H. Stenwig.(1992), Toxin production by C. perfringensisolated
from broiler chickens and capercaillies (Tetrao Urogallus), With and without
necrotizing enteritis , National veterinary institute, Oslo, Norway , 36 (4): 837 - 43.
18. Ilenia Drigo, Fabrizio Agnoletti, Cosetta Bacchin,Francesca Bettini, Monia
Cocchi, Tiziana Ferro, Barbara Marcon, Luca Bano. (2008), Toxin genotyping
of Clostridium perfringens field strains isolated from healthy and diseased
chickens, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Treviso, Italy.
19. I. Svobodová, I. Steinhauserová, M. Nebola. (2007), Incidence of C.
perfringensin Broiler Chickens in the Czech Republic, University of Veterinary
and Pharmaceutical Sciences Brno, Czech Republic.
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội
52
20. Jesus G.M. Silvia G.A., Ana I.A., Francisco R.V. (1999), Use of 16S -23S
ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity, Journal
Microbiol Methods, 36: 55 - 64.
21. Journal of Microbiology Research, pp. 029 - 032.
22. Leen Timbermont, Anouk Lanckriet, Frank Pasmans, Freddy Haesebrouck.
(2009), Intra - species growth -inhibition by C. perfringensis a possible
virulence trait in necrotic enteritis in broilers, Journal Article, Ghent University -524628.
23. Long, J.R. (1973), Necrotic enteritis in broiler chickens. I. A review of the
literature and the prevalence of the disease in Ontario, Canadian Journal of
Comparative Medicine, 37: 302 -308.
24. McDonel, J. L. (1980), Clostridium perfringens toxins (type A, B, C, D, E),
Pharmacol, Ther, 10: 617 - 655.
25. Qiyi Wen và Bruce A. McClalane. (2004), Detection of Enterotoxingenic
Clostridium perfringensType A Isolates in American Retail Foods.
26. Quinn P.J., M.E.Carter, B. Markey, G.R. Carter. (1994), Clostridium species,
Clinal Verternary Microbiology, Wolfe Publishing, 191 - 208.
27. Rocio Crespo và cộng sự(2007), Toxinotypes of Clostridium perfringens
isolated from sick and healthy avian species, J Vet Diagn Invest,19: 329 - 333.
28. Saad Gharaibeh, Rami Al Rifai and Ahmad AL -Majali. (2010), Molecular
typing and antimicrobial susceptibility of C. perfringensfrom broiler chickens,
Department of Pathology and Animal Health, Faculty of Veterinary Medicine,
Jordan Universityof Science and Technology, Irbid, Jordan,22110.
29. Shimizu, T., Ohtani, K., Hirakawa, H., Ohshima, K., Yamashita, A., Shiba, T.,
Ogasawara, N., Hattori, M., Kuhara, S. & Hayashi, H. (2002), Complete genome
sequence of Clostridium perfringens, an anaerobic flesh - eater, Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America , 99: 996 - 1001.
30. SIPOS W. ; FISCHER L. ; SCHINDLER M. ; SCHMOLL F. (2003), Genotyping of
Clostridium perfringensisolated from domestic and exotic ruminants and swine.
GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na
TS. Vũ Ngọc Bội
53
31. Songer J.G. and Dawn Bueschel. (1999), Multiplex PCR Procedure for
GenotypeingClostridium perfringens, Dep. Of Veterinary Science, University of
Arizona, Tucson, Dec16, 1999.
Một số trang web điện tử đã tra cứu
32. http://www.thepoultrysite.com/diseaseinfo/101/necrotic-enteritis
33. http://www.yduocngaynay.com/88YSH_LKCuong_HumanMicrobiome.htm
34. http://www.worldpoultry.net/background/new-discovery-scientiststake-fresh-look-at-poultry-disease-2194.html
35. http://cctytg.wordpress.com/2010/10/16/452/
36. http://www.lrctnu.edu.vn:8080/gsdl/collect/luanvanl/index/assoc/HAS
0199.dir/doc.pdf
37. http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction
38. http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR