Thạc Sĩ Giải mã phân đoạn A hệ gen các chủng virus GUMBORO phân lập ở Việt Nam nhằm cung cấp nguồn gen cho n

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU . 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ BỆNH GUMBORO . 4
1.1.1. Lịch sử và địa dư bệnh . 5
1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh . 6
1.1.3. Cơ chế sinh bệnh . 8
1.1.4. Triệu chứng lâm sàng . 10
1.1.5. Bệnh tích . 10
1.1.6. Chẩn đoán bệnh . 13
1.1.7. Phòng bệnh Gumboro . 13
1.2. SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS GUMBORO . 15
1.2.1. Hệ gen của virus Gumboro . 16
1.2.2. Protein của virus - cấu trúc và chức năng . 19
1.2.3. Kháng nguyên của virus Gumboro . 26
1.2.4. Cơ chế phân tử quá trình nhân lên của IBDV . 28
1.2.5. Cơ chế phân tử của quá trình “chết theo chương trình”
(apoptosis) và hậu quả do virus Gumboro gây ra . 31
1.2.6. Epitope và sự biến đổi tính kháng nguyên và độc lực . 34
1.3. CÁC CHỈ THỊ DI TRUYỀN PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU VIRUS
GUMBORO . 40
1.3.1. Phản ứng RT-PCR thông dụng trong nghiên cứu phân tử virus
Gumboro . 40
1.3.2. Chỉ thị di truyền sử dụng vùng “siêu biến đổi” . 42
1.3.3. Chỉ thị di truyền sử dụng toàn bộ gen kháng nguyên VP2 . 43
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS GUMBORO Ở
VIỆT NAM . 44
1.5. TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC GIẢI MÃ HỆ GEN VIRUS
GUMBORO . 48
Chương 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 51
2.1. NỘI DUNG 51
2.1.1. Giải trình tự chuỗi nucleotide gen kháng nguyên VP2 và phân
đoạn A (VP2-4-3) của virus Gumboro phân lập tại Việt Nam 51
2.1.2. Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả
hệ các chủng Gumboro của Việt Nam và thế giới dựa trên các
gen trong phân đoạn A 51
2.1.3. Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả
hệ các chủng Gumboro của Việt Nam và thế giới dựa trên toàn
bộ phân đoạn A 52
2.2. VẬT LIỆU . 52
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 54
2.3.1 Phương pháp chọn và lấy mẫu 55
2.3.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số . 55
2.3.3. Phương pháp RT-PCR . 56
2.3.4. Phương pháp kiểm tra sản phẩm RT-PCR bằng điện di trên thạch
agarose . 57
2.3.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR . 58
2.3.6. Phương pháp tạo dòng . 58
2.3.7 Phương pháp thu nhận DNA đích trong sản phẩm PCR/RT-PCR
nhiều đoạn . 63
2.3.8. Phương pháp cắt-nối-ghép DNA . 64
2.3.9. Phương pháp giải trình tự . 64
2.3.10 Phương pháp xử lý số liệu sử dụng các phần mềm tin-sinh học . 66
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 71
3.1. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI NUCLEOTIDE GEN KHÁNG
NGUYÊN VP2 VÀ PHÂN ĐOẠN A (VP2-4-3) . 71
3.1.1. Kết quả xác định mẫu bệnh phẩm cung cấp nguồn RNA hệ gen virus 71
3.1.2. Kết quả giải trình tự gen kháng nguyên VP2 . 74
3.1.3. Kết quả giải trình tự phân đoạn A . 77
3.1.3.1. Giải trình tự phân đoạn A chủng BDG23 từ mẫu bệnh
phẩm thu nhận tại Bình Dương . 78
3.1.3.2. Giải trình tự phân đoạn A chủng GHUT-12 từ mẫu bệnh
phẩm thu nhận tại Thừa Thiên-Huế . 81
3.1.3.3. Giải trình tự phân đoạn A từ chủng cường độc cổ điển
G202 phân lập tại Hà Nội . 84
3.1.4. Danh sách đăng ký Ngân hàng gen các chủng Gumboro . 86

3.2. PHÂN TÍCH SO SÁNH THÀNH PHẦN GEN, MỐI QUAN HỆ NGUỒN
GỐC PHẢ HỆ CỦA CÁC CHỦNG GUMBORO VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI
DỰA TRÊN CÁC GEN TRONG PHÂN ĐOẠN A . 89
3.2.1. PHÂN TÍCH GEN VP2 . 91
3.2.1.1. Về thành phần nucleotide, amino acid . 91
3.2.1.2. Phân tích đồng nhất (về nucleotide) và tương đồng (về
amino acid) . 96
3.2.1.3. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ . 100
3.2.2. PHÂN TÍCH GEN VP5 . 103
3.2.2.1. Về thành phần nucleotide và amino acid . 103
3.2.2.2. Phân tích đồng nhất (về nucleotide) và tương đồng (về
amino acid) . 106
3.2.2.3. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ sử dụng gen VP5 108
3.2.3. PHÂN TÍCH GEN VP4 . 109
3.2.3.1. Về thành phần nucleotide và amino acid . 109
3.2.3.2. Phân tích đồng nhất (về nucleotide) và tương đồng (về
amino acid) . 112
3.2.3.3. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ sử dụng gen VP4 113
3.2.4. PHÂN TÍCH GEN VP3 . 115
3.2.4.1. Về thành phần nucleotide và amino acid . 115
3.2.4.2. Phân tích đồng nhất (về nucleotide) và tương đồng (về
amino acid) . 118
3.2.4.3. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ sử dụng gen VP3 119
3.3. PHÂN TÍCH SO SÁNH THÀNH PHẦN GEN, MỐI QUAN HỆ NGUỒN
GỐC PHẢ HỆ CỦA CÁC CHỦNG GUMBORO VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI
DỰA TRÊN TOÀN BỘ PHÂN ĐOẠN A . 121
3.3.1. Phân tích đặc tính sử dụng nucleotide/amino acid để kiến tạo
phân đoạn A (VP2-4-3) ở 3 chủng BDG23, GHUT-12, G202 . 121
3.3.2. Về thành phần nucleotide và amino acid . 124
3.3.3. Phân tích tỷ lệ đồng nhất (về nucleotide) và tương đồng (về
amino acid) . 128
3.3.4. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ . 130
3.4. THẢO LUẬN CHUNG 132
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 140
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ . 142
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 143
PHỤ LỤC . 161

MỞ ĐẦU
Bệnh Gumboro hay còn gọi là bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm, là một
bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan nhanh ở gia cầm non, chủ yếu ở gà và gà tây, do
một loại virus gây ra, có tên gọi là virus gây viêm túi Fabricius truyền nhiễm, hay còn
gọi là virus Gumboro. Bệnh gây thiệt hại rất lớn về mặt kinh tế cho người chăn nuôi.
Ngày nay, bệnh Gumboro xảy ra ở hầu hết các vùng chăn nuôi tập trung trên thế
giới và virus Gumboro gây bệnh có nhiều biến chủng khác nhau nhưng đều thuộc
về serotype I và II, trong đó serotype I có mức độ độc lực và tính gây bệnh cao, còn
serotyp II hầu như không có tính gây bệnh.
Tại Việt Nam, bệnh Gumboro được chính thức phát hiện từ những năm 1980
dựa vào triệu chứng lâm sàng, bệnh tích, dịch tễ học (Bitay và cs, 1984) [3]. Từ đó
đến nay, sau gần 30 năm phát hiện, mặc dù đã có nhiều chương trình phòng chống
và sử dụng nhiều loại vaccine, Gumboro vẫn là bệnh khó xử lý, xảy ra ngày càng
trầm trọng và lan rộng trên toàn quốc, gây thiệt hại lớn.
Virus Gumboro là loại virus có hệ gen là RNA (ribonucleic acid) gồm hai
sợi dương (ds RNA) cuộn tròn được phân làm hai đoạn riêng biệt nên virus
Gumboro thuộc họ Birnaviridae (Dobos và cs, 1979) [55]. Hai phân đoạn trong hệ
gen RNA của virus Gumboro có tên gọi là phân đoạn A và phân đoạn B, đều mang
thông tin di truyền và có nhiệm vụ sinh tổng hợp 5 loại protein từ VP1 đến VP5
(VP = viral protein) của virus, đó là VP1, VP2, VP3, VP4, VP5 (Kibenge và cs,
1988) [92]. Phân đoạn B có độ dài khoảng 2800 nucleotide có chứa bộ phận gen mã
hóa cho protein VP1. Protein VP1 tham gia vào quá trình tái tạo virus Gumboro với
chức năng enzyme xúc tác RNA-polymerase (Tacken và cs, 2002) [183]. Phân đoạn
A có độ dài khoảng 3200 nucleotide, mã hóa cho protein chung gồm VP2, 4, 3 và
một protein khác khung đọc là VP5, trong đó VP2 là một protein kháng nguyên của
virus Gumboro. VP2 có độ bảo tồn cao về thành phần nucleotide ở hai đầu 5’ và 3’,
nhưng lại có một vùng khoảng 500 nucleotide ở giữa của gen rất thay đổi ở các
chủng khác nhau, gọi là vùng “siêu biến đổi” (hypervariable region) (Yuwen và cs,
2008) [211]. Thực chất tất cả quần thể virus Gumboro đều thuộc họ Birnaviridae,
nhưng VP2 của các chủng khác nhau có vùng “siêu biến đổi” có thành phần amino
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp 1


acid không đồng nhất. Vùng này bao gồm 120 - 150 amino acid mà ở đó có một số
amino acid quan trọng, chúng là các amino acid khung cấu tạo nên epitope kháng
nguyên và độc lực. Sự thay đổi của một, hai hay vài amino acid được gọi là epitope
trong vùng này có tính chất quyết định đến sự kết hợp kháng thể do chúng hoặc do
các chủng đồng kháng nguyên khác kích thích sinh ra. Nếu không đồng nhất về thành
phần khung epitope, kháng nguyên vaccine sử dụng có thể kích thích sinh kháng thể
với hàm lượng cao nhưng kháng thể này không thể hoặc không hoàn toàn trung hòa
được chủng virus gây bệnh khác vì không có vị trí kết hợp kháng nguyên - kháng thể
tương ứng, do sai lệch về epitope của vaccine với chủng cường độc gây bệnh, và như
vậy mặc dù đàn gà được tiêm vaccine nhưng bệnh vẫn nổ ra (Letzel và cs, 2007)
[113]. Đứng trước tình hình này, việc nghiên cứu một loại vaccine đa chủng, mà đặc
biệt là vaccine thế hệ mới để phòng bệnh Gumboro cho đàn gia cầm là hết sức cần
thiết và trên thế giới hiện nay, nghiên cứu cơ bản và phát triển vaccine vẫn không
ngừng được đẩy mạnh, nhằm tiến tới có được những phương thức và loại hình
vaccine tốt nhất phòng chống bệnh Gumboro (Müller và cs, 2003) [133].
Vaccine thế hệ mới hay còn gọi là vaccine công nghệ gen là sản phẩm kết
quả của quá trình thao tác và can thiệp của kỹ thuật gen đối với gen kháng nguyên
của một hay nhiều loại vi sinh vật cần phòng chống, trong đó có virus Gumboro
đang ngày càng được quan tâm. Nguồn nguyên liệu về gen và hệ gen của virus gây
bệnh phải được phân lập, tách dòng, giải trình tự và phân tích đặc tính sinh học
phân tử của chúng, đồng thời một khi nguồn gen đó đã được gài vào plasmid thì
việc thu thập, lưu giữ làm nguyên liệu khung tạo nên thư viện gen để tiến hành các
công đoạn tiếp theo là kết sức thuận lợi.
Để có nguồn gen của một số chủng virus Gumboro có tại Việt Nam, từ đó
làm cơ sở dữ liệu cho nghiên cứu về gen và hệ gen của virus Gumboro, cũng như
tạo nguồn nguyên liệu gen để có thể sử dụng cho các chế phẩm thế hệ mới (chế
phẩm chẩn đoán, vaccine thế hệ mới .), chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Giải mã phân đoạn A hệ gen các chủng virus Gumboro phân lập ở Việt Nam
nhằm cung cấp nguồn gen cho nghiên cứu vaccine thế hệ mới”.
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp 2


Mục tiêu của đề tài là: giải mã phân đoạn A và gen VP2 của một số chủng
Gumboro tại Việt Nam, lưu giữ gen kháng nguyên VP2 và phân đoạn A trong
plasmid, phân tích đặc điểm sinh học phân tử của chúng nhằm có được dữ liệu và
nguyên liệu cho nghiên cứu vaccine thê hệ mới.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Gumboro có thể được coi là một bệnh cổ điển của ngành chăn nuôi gà công
nghiệp. Có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh, virus gây bệnh và vaccin phòng
bệnh song bệnh vẫn bùng phát.
Ở Việt Nam, virus Gumboro cũng rất đa dạng và phức tạp do chúng ta nhập
khẩu con giống từ nhiều nước khác nhau trên thế giới, khi có bệnh xảy ra chúng ta
không biết được virus Gumboro đang mắc thuộc chủng nào và vì thế việc phòng
bệnh chưa đạt hiệu quả như mong muốn.
Việc nghiên cứu trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen của virus đã được thế giới
công bố. Tại Việt Nam, cho đến thời điểm chúng tôi nghiên cứu công trình này,
chưa có một nghiên cứu nào về vấn đề giải mã toàn bộ phân đoạn A và hệ gen của
virus Gumboro phân lập nội địa.
Bằng việc thu thập các chủng virus Gumboro đương nhiễm ở Việt Nam, xem
xét sự biến đổi về thành phần gen, tính kháng nguyên và độc lực, nguồn gốc và mối
quan hệ phả hệ của các chủng virus này, sẽ giúp chúng ta có hướng tạo ra các chế
phẩm để phòng bệnh này một cách hiệu quả.
Đề tài được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.