Đồ Án Dùng cột sắc ký ái lực miễn dịch và huỳnh quang kế định lượng ochratoxin a

TÓM TẮT KHÓA LUẬN



BÙI THỊ CẨM NHUNG, Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, tháng 08/2006, “DÙNG CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC MIỄN DỊCH VÀ HUỲNH QUANG KẾ ĐỊNH LƯỢNG OCHRATOXIN A”.
Hướng dẫn khoa học:

1. PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang

2. TS. Nguyễn Ngọc Hải

Đề tài được tiến hành từ ngày 06/02/2006 đến ngày 30/06/2006 tại Phòng MiễnDịch – Viện Pasteur TPHCM.
Đối tượng được nghiên cứu trong đề tài là độc tố ochratoxin A. Ochratoxin là độc tố gây tác hại vào các cơ quan quan trọng của cơ thể như: thần kinh, gan, thận và hệ miễn dịch. OTA gây hậu quả nghiêm trọng đối với người và động vật nuôi ở nồng độ cực thấp (ppb).
Sắc ký ái lực miễn dịch (Immuno Affinity Chromatography – IAC) được sử dụng với 2 mục đích chính:
Đồng thời vừa tinh sạch vừa cô đặc độc tố.

Định lượng trực tiếp theo phương pháp huỳnh quang kế. Mục đích của đề tài:
Tạo cột sắt ký ái lực bắt ochratoxin.

Xác định các điều kiện tối ưu trong việc dùng cột sắc ký ái lực miễn dịch và huỳnh quang kế trong định lượng ochratoxin A (OTA), cụ thể xác định hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với OTA
Kết quả đạt được như sau:

1. Tạo được cột IAC có khả năng bắt giữ OTA.

2. Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với OTA chuẩn tốt (đạt trên 90%).

3. Hiệu suất thu hồi OTA trong mẫu tự tạo (bia) đạt yêu cầu khi lượngOTA nhiễm trong mẫu dưới 20 ng (đạt trên 90%).


MỤC LỤC

NỘI DUNG TRANG Bìai Trang tựa ii Lời cảm ơn iii
Tóm tắt khóa luận iv Mục lục .v Danh sánh các từ viết tắt. viii
Danh sách các bảng .ix Danh sách các hình và các biểu đồ .x
Chương 1. MỞ ĐẦU.1
1.1 Đặt vấn đề .1

1.2 Mục đích của đề tài .2

1.3 Nội dung thực hiện2

Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU3

2.1 Nấm mốc .3

2.2 Độc tố nấm mốc 3

2.3 Độc tố ochratoxin5

2.3.1 Giới thiệu .5

2.3.2 Các loài nấm mốc sinh ochratoxin .6

2.3.3 Cấu trúc hóa học của ochratoxin 7

2.3.4 Tính chất hóa lý của ochratoxin .8

2.3.5 Độc tính và tình hình nhiễm ochratoxin A .8

2.3.6 Các quy định về ochratoxin trong thực phẩm 10

2.4 Các phương pháp phân tích ochratoxin 10

2.4.1 Các phương pháp hóa lý .10

2.4.1.1 Sắc ký mỏng lớp (TCL) .11

2.4.1.2 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC)12

2.4.2 Các phương pháp sinh học .12

2.4.2.1 Phương pháp thử nghiệm miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) .12

2.4.2.2 Phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch (IAC) 13

2.4.3 Sơ lược cách chế tạo cột IAC do viện Pasteur sản xuất .14

2.4.3.1 Gây miễn dịch thỏ và thu kháng huyết thanh kháng OTA 14

2.4.3.2 Tinh chế kháng thể kháng OTA .14

2.4.3.3 Cộng hợp IgGOTA lên Sepharose 4B và tạo cột IAC 14

Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài16

3.2 Vật liệu 16

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu .16

3.2.2 Thiết bị16

3.2.3 Dụng cụ.16

3.2.4 Hóa chất 16

3.3 Phương pháp .17

3.3.1 Các phương pháp phục vụ nghiên cứu .17

3.3.1.1 Phương pháp quang phổ kế xác định nồng độ OTA 17

3.3.1.2 Phương pháp huỳnh quang kế đo hàm lượng ochratoxin 18

3.3.1.3 Chuẩn bị dung dịch OTA chuẩn và xác định nồng độ .18

3.3.2 Quy trình tạo cột IAC .19

3.3.2.1 Chuẩn bị kháng thể19

3.3.2.2 Chuẩn bị gel 19

3.3.2.3 Cộng hợp IgG vào Sepharose .19

3.3.2.4 Nén cột .19

3.3.3 Xây dựng mối tương quan giữa lượng OTA (đo bằng huỳnh quang)

trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế (methanol) .20

3.3.4 Dựng đường chuẩn OTA 21

3.3.5 Quy trình tinh chế, cô đặc bằng cột IAC và định lượng bằnghuỳnh quang kế .21

3.3.6 Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu trắng .22

3.3.7 Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu tự tạo .23

3.3.7.1 Phương pháp chọn mẫu nền 23

3.3.7.2 Phương pháp tạo mẫu giả 23

3.3.7.3 Hiệu xuất thu hồi của cột IAC đối với mẫu bia Sài Gòn 23

3.3.8 Tình hình nhiễm OTA của một số mẫu thực phẩm trên thị trường .24

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 24

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch .25

4.2 Xây dựng mối tương quan tuyến tính giữa lượng OTA (đo bằng

huỳnh quang kế) trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế (methanol) .25

4.3 Dựng đường chuẩn OTA .27

4.4 Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu trắng 28

4.5 Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu bia29

4.6 Tình hình nhiễm OTA của một số mẫu thực phẩm trên thị trường .30

Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .31

5.1 Kết luận 31

5.2 Đề nghị .31

TÀI LIỆU KHAM KHẢO .32

TIẾNG VIỆT.32

TIẾNG ANH .33

TRANG WEB .33

PHỤ LỤC 34

Chương 1. MỞ ĐẦU


Sự hiện diện của vi sinh vật nói chung và nấm mốc nói riêng là một trong những rào cản kinh tế đối với việc xuất khẩu thực phẩm của nước ta. Trong tình hình phát triển kinh tế theo hướng hội nhập như hiện nay, công tác kiểm tra chất lượng thực phẩm cần phải được chú trọng.
Với khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, Việt Nam là nước thích hợp cho sự sinh sản và phát triển của nấm mốc. Do đó nấm mốc có mặt khắp mọi nơi: đất, nước, không khí, nguyên vật liệu, lương thực, thực phẩm Cùng với việc bảo quản chưa tốt, các loại thực phẩm như: bia, cà phê, ngũ cốc dễ dàng bị nhiễm nấm mốc và sinh độc tố. Ochratoxin là một trong những độc tố nguy hiểm. Ngộ độc cấp tính do ăn phải thức ăn có nồng độ ochratoxin cao dẫn đến co giật, nôn, mệt lã, tê liệt và có thể gây tử vong. Dài hạn ochratoxin còn gây, viêm thận, ung thư, sẩy thai. Vì vậy công tác định lượng và định tính ochratoxin là rất cần thiết. Quy trình phân tích ochratoxin bằng các phương pháp như: sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng cao áp (HPLC) thường phải qua nhiều giai đoạn chiết xuất, làm sạch, cô đặc, dễ bị sai số do phải qua nhiều thao tác, tăng thất thoát trong các công đoạn. Trước những khó khăn trên, sắc ký ái lực miễn dịch (Immuno Affinity Chromatography – IAC) ra đời, sử dụng trong công đoạn vừa tinh sạch vừa cô đặc độc tố, dựa trên nguyên lý gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, tạo khả năng chọn lọc cao mà các phương pháp khác không có được, quy trình chiết và tinh chế ochratoxin của phương pháp IAC lại đơn giản đã đáp ứng được nhu cầu về độ tin cậy cao trong các kết quả phân tích.
Từ những cơ sở trên, phòng Miễn Dịch – Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh đã tiến hành thực hiện đề tài “ Sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt ochratoxin A ”. Cột sắc ký ái lực tạo nên đã cho hiệu quả cao trong phân tích định lượng ochratoxin A.
Được sự đồng ý của Bộ môn CNSH, trường Đại Học Nông Lâm TPHCM, dưới sự hướng dẫn của PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang, TS. Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:“Dùng cột sắc ký ái lực miễn dịch và huỳnh quang kế định lượng ochratoxin A”.
1.2 Mục đích của đề tài
Tạo cột sắt ký ái lực bắt ochratoxin.

Xác định các điều kiện tối ưu trong việc dùng cột sắc ký ái lực miễn dịch và huỳnh quang kế trong định lượng ochratoxin A (OTA).
1.3 Nội dung thực hiện

Tạo giá ái lực bắt ochratoxin A trên cơ sở đã có kháng thể kháng OTA.
Tiến hành xác định hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với OTA trong mẫu trắng và mẫu tự tạo.
Đánh giá tình hình nhiễm OTA của một số mẫu thực phẩm trên thị trường.