Thạc Sĩ Dòng hóa, biểu hiện và tinh sạch beta – galactosidase trong Escherichia coli

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
TP. HCM, Năm 2011

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT . v
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC CÁC HÌNH . vii
DANH MỤC ĐỒ THỊ . 9
MỞ ĐẦU . 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Enzyme beta-galactosidase 5
1.1.1 Giới thiệu . 5
1.1.2. Cơ chế . 6
1.1.3. Cấu trúc beta-galactosidase nguồn gốc E.coli 7
1.1.4. Ứng dụng 7
1.1.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất beta-galactosidase trong và ngoài nước 7
1.2. Lactose . 8
1.3. Giới thiệu chung về Galacto-oligosaccharide (GOS) từ lactose 9
1.3.1. Cấu trúc GOS . 9
1.3.2. Cơ chế tổng hợp GOS 10
1.3.3. Đặc điểm GOS 11
1.3.4. Ứng dụng 13
1.4. Tế bào E.coli và sự biểu hiện protein tái tổ hợp 13
1.4.1. Đặc điểm E.coli 13
1.4.2. Các chủng E.coli dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp . 14
1.5. Một vài hệ thống vector biểu hiện protein . 15
1.5.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST . 15

1.5.2. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP-Hệ thống pMAL 15
1.5.3. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP 16
1.5.4. Hệ thống pTrcHis trong sản xuất protein tái tổ hợp dung hợp 6xHis 16

Chương 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu 18
2.1.1 Gen mã hóa beta-galactosidase . 18
2.1.2. Chủng vi sinh vật 18
2.1.3. Plasmid dùng trong thí nghiệm 19
2.1.4. Mồi khuếch đại gen LacZ . 21
2.1.5. Thang phân tử dùng trong điện di DNA/RNA . 21
2.2. Dụng cụ - thiết bị 22
2.2.1. Dụng cụ thiết bị thông dụng . 22
2.2.2. Thiết bị dùng trong sinh học phân tử . 22
2.2.3. Thiết bị dùng trong thao tác nuôi cấy vi sinh . 22
2.2.4 Thiết bị dùng cho tinh chế protein 23
2.3. Hóa chất và môi trường 23
2.3.1 Hóa chất . 23
2.3.2 Môi trường . 26
2.4. Phương pháp . 27

2.4.1. Thiết kế mồi chuyên biệt 27
2.4.2. Xác định gen LacZ trên ngân hàng gen 28
2.4.3. Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến . 29
2.4.4. Phương pháp tách chiết thu plasmid 29
2.4.5. Phương pháp điện di DNA . 30
2.4.5.1. Nguyên tắc 30
2.4.5.2. Phương pháp . 31
2.4.6. Tạo chủng E.coli Mach1 ™ -T1R mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ
mã hóa beta-galactosidase 31
2.4.6.1. Thu nhận gen LacZ . 32

2.4.6.2. Thiết lập phản ứng nối gen LacZ vào plasmid pCR®-XL-TOPO® 36
2.4.6.3. Điện biến nạp plasmid pCR®-XL-TOPO®/LacZ vào tế bào E.coli
Mach1™ -T1R khả biến. 36
2.4.7. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pCR®-XL-TOPO®/LacZ 37
2.4.7.1. Kiểm tra dòng mang Plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR. . 37
2.4.7.2. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pCR®-XL-TOPO®/LacZ bằng enzyme cắt
giới hạn . 38
2.4.8. Tinh sạch thu băng LacZ trên gel agarose điện di với crystal violet 38
2.4.9. Tạo dòng đưa gen LacZ vào plasmid pTrcHisB . 39
2.4.9.1. Cắt tạo plasmid pTrcHisB đầu dính bằng hai enzyme XhoI và HindIII 39
2.4.9.2. Thực hiện phản ứng nối gen LacZ vào plasmid pTrcHisB . 40
2.4.9.3. Điện biến nạp chuyển plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ vào E.coli
DH5α khả biến 40
2.4.9.4. Kiểm tra dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ . 41
2.4.10. Tạo dòng E.coli BL21(DE3) có khả năng biểu hiện beta-galactosidase hoạt
tính 43
2.4.11. Điện di SDS-PAGE 43
2.4.11.1. Nguyên tắc 43
2.4.11.2. Phương pháp SDS-PAGE . 43
2.4.12. Cảm ứng biểu hiện và xác nhận sự biểu hiện của 6xHis- betagalactosidase . 44
2.4.12.1. Cảm ứng biểu hiện . 44
2.4.12.2. Kiểm tra sự biểu hiện của 6xHis-betagalactosidase bằng phương pháp
SDS-PAGE . 45
2.4.12.3. Kiểm tra phân đoạn thu 6xHis- betagalactosidase 45
2.4.13. Thử khả năng thu hồi 6xHis- betagalactosidase với hạt Ni-NTA, dùng
Imidazol ở tỷ lệ khác nhau . 47
2.4.14. Xác định nhiệt độ, pH tối ưu cho enzym 6x-betagalactosidase . 47
2.4.15. Thử khả năng sinh GOS từ enzym beta-galactosidase thu được bằng sắc ký lỏng HPLC. 48


Chương 3: Kết Quả - Biện Luận

3.1.Tạo dòng gen LacZ trong plasmid pCR-XL-TOPO® vào tế bào E.coli
Match1TM-T1R khả biến. 50
3.1.1. Tổng hợp gen LacZ mã hóa beta-galactosidase . 50
3.1.2. Tạo dòng gen LacZ vào plasmid pCR-XL-TOPO®. . 51
3.2. Kiểm tra dòng E.coli Match1TM-T1R mang Plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ .
. 53
3.2.1. Dùng phương pháp cắt hạn chế kiểm tra dòng E.coli Match1TM-T1R mang
Plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ, thu gen LacZ 53
3.2.2. Giải trình tự so sánh trình gen LacZ thu được với gen LacZ trên plasmid
pAc5.1/V5-HisB/LacZ. 54
3.3. Tạo dòng gen LacZ vào plasmid pTrcHisB trong tế bào E.coli DH5α . 61
3.4. Tạo dòng tế bào E.coli BL21(DE3) mang plasmid pTricHisB/LacZ, . 64
3.5. Kiểm tra khả năng biểu hiện enzyme beta-galactosidase hoạt tính dạng dung
hợp 6xHis-betagalactosidase . 65
3.6. Định tính khả năng biểu hiện 6xHis-betagalactosidase có hoạt tính trong E.coli
BL21(DE3) 66
3.7. Xác định phân đoạn thu 6xHis-betagalactosidase trong E. coli BL21(DE3) 69
3.8. Thử khả năng thu hồi 6xHis-LacZ với hạt Ni-NTA, dùng Imidazol ở tỷ lệ khác
nhau. 70
3.9. Xác định nhiệt độ, pH tối ưu của enzym 6xHis-betagalactosidase 71
3.9.1. xác định nhiệt độ tối ưu 71
3.9.2. Xác định pH tối ưu . 73
3.10. Thử khả năng sinh GOS, phát hiện sản phẩm bằng sắc ký lỏng HPLC 74

Chương 4: Kết Luận – Đề Nghị

4.1. Kết luận 77
4.2. Kiến nghị 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78
PHỤ LỤC 84


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Sự tạo thành các IRMOF ở các điều kiện tổng hợp khác nhau 34
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình tạo thành axít azobenzen 4,4’-dicarboxylic .42
Bảng 4.1: Kết quả phân tích nguyên tố được tính toán về mặt lý thuyết so với kết quả thực nghiệm 50
Bảng 4.3: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand AD
ở nồng độ 0,002 M, nhiệt độ 80oC 52
Bảng 4.4: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand AD
ở nồng độ 0,002 M, nhiệt độ 85oC 53
Bảng 4.5: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand AD
ở nồng độ 0,002 M , nhiệt độ 90oC .54
Bảng 4.6: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand AD
ở nồng độ 0,002 M , nhiệt độ 95oC .55
Bảng 4.7: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand AD
ở nồng độ 0,002 M, nhiệt độ 100oC 56
Bảng 4.28: Sự kết tinh tinh thể MOF trong dung môi DMF/DMSO tỉ lệ 5,5 : 0,5, nồng độ AD 0,01 M, tỉ lệ AD/Zn =1 : 1 63
Bảng 5.1: Kết quả phân tích nguyên tố C, N của vật liệu .77
Bảng 4.2: Kết quả khảo sát tỉ lệ mol giữa axít azobenzen 4,4’-dicarboxylic (AD) với các muối kim loại (Mn(CH3COO)2.4H2O; Pb(NO3)2; Cu(CH3COO)2.H2O; Ce(NO3)3.6H2O) ở nồng độ mol của AD ở 0,002M; 0,004M; 0,006M; 0,008M; 0,01M trong dung môi DMF 101
Bảng 4.8: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand AD
ở nồng độ 0,004 M, nhiệt độ 80oC 102
Bảng 4.9: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand AD
ở nồng độ 0,004 M, nhiệt độ 85oC 103
Bảng 4.10: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand
AD ở nồng độ 0,004 M, nhiệt độ 90oC 104

Bảng 4.11: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand
AD ở nồng độ 0,004 M, nhiệt độ 95oC 105
Bảng 4.12: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand
AD ở nồng độ 0,004 M, nhiệt độ 100oC .106
Bảng 4.13: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand
AD ở nồng độ 0,006 M, nhiệt độ 80oC .107
Bảng 4.14: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand
AD ở nồng độ 0,006 M, nhiệt độ 85oC .108
Bảng 4.15: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand
AD ở nồng độ 0,006 M, nhiệt độ 90oC .109
Bảng 4.16: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand
AD ở nồng độ 0,006 M, nhiệt độ 95oC .110
Bảng 4.17: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand
AD ở nồng độ 0,006 M, nhiệt độ 100oC .111
Bảng 4.18: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand
AD ở nồng độ 0,008 M, nhiệt độ 80oC .112
Bảng 4.19: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand
AD ở nồng độ 0,008 M, nhiệt độ 85oC .113
Bảng 4.20: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand
AD ở nồng độ 0,008 M, nhiệt độ 90oC .114
Bảng 4.21: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand
AD ở nồng độ 0,008 M, nhiệt độ 95oC .115
Bảng 4.22: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand
AD ở nồng độ 0,008 M, nhiệt độ 100oC .116
Bảng 4.23: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand
AD ở nồng độ 0,01 M, nhiệt độ 80oC .117
Bảng 4.24: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand
AD ở nồng độ 0,01 M, nhiệt độ 85oC .118

AD ở nồng độ 0,01 M, nhiệt độ 95oC .120
Bảng 4.27: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO3)2.4H2O và ligand
AD ở nồng độ 0,01 M, nhiệt độ 100oC .121



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 2.1: Cấu trúc khung hữu cơ kim loại nghiên cứu theo từng năm .14
Hình 2.2: Đường biểu diễn quá trình nghiên cứu vật liệu cấu trúc khung lỗ xốp có kích thước micro .15
Hình 2.3: Sự tạo thành góc liên kết giữa nguyên tử kim loại chuyển tiếp - phân tử
hữu cơ imidazol - nguyên tử kim loại chuyển tiếp .16
Hình 2.4: Các loại imidazol dùng trong tổng hợp ZIF .17
Hình 2.5: Một số loại ZIF đã được tổng hợp được trong phòng thí nghiệm của
Omar Yaghi .17
Hình 2.6: Mối liên hệ giữa diện tích bề mặt và kích thước lỗ xốp trong vật liệu ZIFs
18
Hình 2.7: a) Sự trùng ngưngcủa axít boronic thành boroxine anhydride 19 b) Sự trùng ngưng của axít diboronic tạo thành COF-1. 19
Hình 2.8:Những phản ứng trùng ngưng của axít boric, axít diboronic được sử dụng
để tạo thành khung mạng COF mở rộng .20
Hình 2.9: Sự trùng ngưng tert-butylsilan triol A vớiaxít boronic B tạo thành khung borosilicat C. Sự trùng ngưng A với D tạo thành E với nguyên tử Bo xảy ra ở đỉnh của ba góc liên kết với nhau tạo thành khối tetraheral D cho ra COF-202 F .21
Hình 2.10: Mô hình liên kết giữa cầu nối hữu cơ với ion kim loại tạo thành vật liệu MOF 22
Hình 2.11: Các cầu nối hữu cơ dùng trong tổng hợp MOF 23
Hình 2.12: Mô hình hóa cluster dùng trong tổng hợp MOF 24
Hình 2.13: Cluster của ion kim loại có cấu trúc tứ diện liên kết với cầu nối hữu cơ có 1 tâm phối trí, cấu trúc MOF tạo thành sẽ có dạng cơ bản như mạng tinh thể kim cương .25
Hình 2.14: Cluster của ion kim loại có cấu trúc bát diện liến kết với cầu nói hữu cơ
có 2 tâm phối trí, cấu trúc MOF tạo thành sẽ có dạng cơ bản như mạng lập phương
Hình 2.15: Các loại axít dicarboxylic dùng cho quá trình tổng hợp 27
Hình 2.16: Axít Trimesic (axít 1,3,5-benzentricarboxylic) dùng trong tổng hợp HKUST-1 28
Hình 2.17: MOF(HKUST-1) được tạo thành với các rãnh hình vuông có đường kính 10 Å .28
Hình 2.18: Axít 2,5-dihydroxyterephthalic dùng trong tổng hợp COP-27 29
Hình 2.19: Cấu trúc COP-27 có các rãnh đường kính 10 Å với tâm là Co (màu hồng), các nguyên tử carbon (màu xám), các nguyên tử oxi có tính chất hấp thụ vật lý với nước (màu đỏ) .29
Hình 2.20: Mô tả sự tạo thành MOF từ ion cluster kim loại với cầu nối hữu cơ có góc liên kết khác nhau .30
Hình 2.21: Mô hình hóa cách tạo liên kết bên trong cấu trúc MOF-5 .31
Hình 2.22: Sự tạo thành cấu trúc ba chiều trong tinh thể MOF-5. .
32 a) Cấu trúc MOF-5 được tạo thành từ cluster Zn4O liên kết với benzen1,4- dicarboxylat tạo thành khung mạng lập phương.
32 b) Cấu trúc MOF-5 được mô hình hóa dưới dạng cầu và que.
32c) Cấu trúc MOF-5 được bao bọc cluster (OZn4)O12 với ion benzen1,4- dicarboxylat .32
Hình 2.23: Biểu diễn cấu trúc không gian tạo thành MOF-177. 33 a) Một phân tử 1,3,5-tribenzenbezoat liên kết với 3 cluster Zn4O. .33 b) Hình chiếu của cấu trúc MOF-177 xuống mặt [001]. 33 c) Một phần của cấu trúc từ một tâm của cluster Zn4O 33
Hình 2.24: Các IRMOF được mô hình hóa 35
Hình 2.25: Mô hình hóa khả năng hấp thụ CO2 của MOF-177 .36
Hình 2.26: Mô tả sự lưu trữ khí H2 của một số loại MOF .37
Hình 2.27: Sự lưu giữ khí CO2 ở nhiệt độ phòng với các loại MOF khác nhau 37
Hình 2.28: Phản ứng Benzoic aldehyde với Me3SiCN sử dụng xúc tác Cd(II) 4,4’- bipyridine ở 313K, 24 giờ, hiệu suất phản ứng 77% 38

Hình 2.29: Đường đẳng nhiệt của quá trình hấp/ giải hấp của ba vật liệu được nghiên cứu ở nhiệt độ phòng (phần bên dưới). Từ trái sang phải phần ở trên là cấu trúc của M-CPO-27 (M = Ni/Co), HKUST-1 và M-MIL-53 (M = Al/Cr). 39
Hình 3.1 : Sơ đồ mô tả các quá trình tổng hợp ligand AD .41
Hình 3.2 Quy trình hoạt hóa mẫu .44
Hình 4.1: Phổ NMR 1H của sản phẩm sau 12 giờ phản ứng tại 50oC 45
Hình 4.2: Phổ hồng ngoại của sản phẩm sau 3 giờ phản ứng tại 80oC 46
Hình 4.3: Phổ LC-MS của sản phẩm sau 3 giờ phản ứng tại 80oC .47
Hình 4.4: Phổ 1H-NMR của sản phẩm sau 3 giờ phản ứng tại 80oC 48
Hình 4.5: Phổ 13C-NMR của sản phẩm sau 3 giờ phản ứng tại 80oC .49
Hình 4.6: Công thức cấu tạo của axít azobenzen 4,4’-dicarboxylic a) dạng cis b)
dạng trans 50
Hình 4.7. Tinh thể tạo thành trong hỗn hợp AD (0,008 M)/Zn (0,002 M) trong dung môi DMF, nhiệt độ 85oC. 51
Hình 4.8: Tinh thể tạo thành từ AD (0,002 M) và Zn, tỉ lệ AD/Zn a) 1 : 4; b) 1: 2; c)
1 : 1; d) 2 : 1, trong dung môi DMF, thời gian 2 ngày, nhiệt độ 85oC 57

Hình 4.9: Tinh thể tạo thành từ AD và Zn (0,004 M), tỉ lệ (a) 1 : 3;(b )1 :1;(c)2 : 5; (d)1 : 4), trong dung môi DMF, thời gian 3 ngày, nhiệt độ 85oC 58
Hình 4.10: Tinh thể tạo thành từ ligand AD (0,006 M) và Zn ở tỉ lệ (a) 1:1; 59 (b) 3 : 1;(c) 2 : 1, (d) 3 : 4, trong dung môi DMF, thời gian 2 ngày, nhiệt độ 90oC .59
Hình 4.11: Tinh thể tạo thành từ AD và Zn (0,008 M), tỉ lệ (a) 1 : 1;(b) 3 : 1; .60 (c) 1 : 3, (d) 2 : 3, trong dung môi DMF, thời gian 1 ngày, nhiệt độ 95oC 60
Hình 4.12: Tinh thể tạo thành từ ligand AD (0,01 M) và Zn ở tỉ lệ (a) 1 : 3; .61 (b) 1 : 2; (c)1:1, (d) 3 :4, trong dung môi DMF, thời gian 1 ngày, nhiệt độ 90oC .61
Hình 4.13: Tinh thể MOF kết tinh trong DMF/DMSO = 5,5 : 0,5, với nồng độ AD :
0,01M, tỉ lệ AD/Zn = 1 : 1, sau 4 ngày dung môi nhiệt tại a) nhiệt độ 80oC, b) nhiệt
độ 90oC 63

Hình 4.14: Ảnh tinh thể tổng hợp ở nhiệt 90oC, nồng độ AD 0,01 M, tỉ lệ AD / Zn =
1 : 1, sau 1 ngày, pH của dung dịch 4,22 (a), 4,32 (b), 4,54(c), 4,75 (d), 4,85(e), 5,20 (f). 64
Hình 4.15:Ảnh hiển vi của vật liệu được tổng hợp trong điều kiện tỉ lệ nồng độ AD
0,01 M, tỉ lệ AD/Zn = 1 : 1, thời gian ủ nhiệt 5 ngày tại 80oC,tương ứng với giá trị
pH của dung dịch là 4,4 (a), 4,68 (b), 4,86(c), 5,02 (d), 5,25(e) .65
Hình 4.16: Nhiễu xạ tia X của vật liệu trong trường hợp 1 67
Hình 4.17: Nhiễu xạ tia X của axít azobenzen 4,4’-dicarboxylic 67
Hình 4.18: Phổ nhiễu xạ tia X của vật liệu trong trường hợp 2 .68
Hình 4.19: Phổ nhiễu xạ tia X của vật liệu trong trường hợp 3 .69
Hình 4.20: Giản đồ phân tích nhiệt của vật liệu trong trường hợp 1 .70
Hình 4.21: Giản đồ phân tích nhiệt của vật liệu trong trường hợp 2 .71
Hình 4.22: Giản đồ phân tích nhiệt của vật liệu trong trường hợp 3 .72
Hình 4.23: Đường hấp phụ đẳng nhiệt a) mô hình BET, b) Langmuir của vật liệu trường hợp 1 73
Hình 4.24: Đường hấp phụ đẳng nhiệt của vật liệu tổng hợp theo trường hợp 2 theo mô hình BET (a), mô hình Langmuir (b) 74
Hình 4.25: Đường đẳng nhiệt hấp thụ của vật liệu ở trường hợp 3 75
Hình 4.26: Sự phân bố kích thước lỗ theo phương pháp DUBININ – ASTAKHOV (DA) 76
Hình 5.1: Mô hình hóa cấu trúc vật liệu về mặt lý thuyết bằng phần mềm crystal maker .77
Hình 5.2. Cấu trúc đơn tinh thể của vật liệu tổng hợp ở trường hợp 3 78



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 2.1: Cấu trúc khung hữu cơ kim loại nghiên cứu theo từng năm .14
Hình 2.2: Đường biểu diễn quá trình nghiên cứu vật liệu cấu trúc khung lỗ xốp có kích thước micro .15
Hình 2.3: Sự tạo thành góc liên kết giữa nguyên tử kim loại chuyển tiếp - phân tử
hữu cơ imidazol - nguyên tử kim loại chuyển tiếp .16
Hình 2.4: Các loại imidazol dùng trong tổng hợp ZIF .17
Hình 2.5: Một số loại ZIF đã được tổng hợp được trong phòng thí nghiệm của
Omar Yaghi .17
Hình 2.6: Mối liên hệ giữa diện tích bề mặt và kích thước lỗ xốp trong vật liệu ZIFs
.18
Hình 2.7: a) Sự trùng ngưngcủa axít boronic thành boroxine anhydride 19 b) Sự trùng ngưng của axít diboronic tạo thành COF-1. 19
Hình 2.8:Những phản ứng trùng ngưng của axít boric, axít diboronic được sử dụng
để tạo thành khung mạng COF mở rộng .20
Hình 2.9: Sự trùng ngưng tert-butylsilan triol A vớiaxít boronic B tạo thành khung borosilicat C. Sự trùng ngưng A với D tạo thành E với nguyên tử Bo xảy ra ở đỉnh của ba góc liên kết với nhau tạo thành khối tetraheral D cho ra COF-202 F .21
Hình 2.10: Mô hình liên kết giữa cầu nối hữu cơ với ion kim loại tạo thành vật liệu MOF 22
Hình 2.11: Các cầu nối hữu cơ dùng trong tổng hợp MOF 23
Hình 2.12: Mô hình hóa cluster dùng trong tổng hợp MOF 24
Hình 2.13: Cluster của ion kim loại có cấu trúc tứ diện liên kết với cầu nối hữu cơ có 1 tâm phối trí, cấu trúc MOF tạo thành sẽ có dạng cơ bản như mạng tinh thể kim cương .25
Hình 2.14: Cluster của ion kim loại có cấu trúc bát diện liến kết với cầu nói hữu cơ
có 2 tâm phối trí, cấu trúc MOF tạo thành sẽ có dạng cơ bản như mạng lập phương
.26
Hình 2.15: Các loại axít dicarboxylic dùng cho quá trình tổng hợp 27


Hình 2.16: Axít Trimesic (axít 1,3,5-benzentricarboxylic) dùng trong tổng hợp HKUST-1 28
Hình 2.17: MOF(HKUST-1) được tạo thành với các rãnh hình vuông có đường kính 10 Å .28
Hình 2.18: Axít 2,5-dihydroxyterephthalic dùng trong tổng hợp COP-27 29
Hình 2.19: Cấu trúc COP-27 có các rãnh đường kính 10 Å với tâm là Co (màu hồng), các nguyên tử carbon (màu xám), các nguyên tử oxi có tính chất hấp thụ vật lý với nước (màu đỏ) .29
Hình 2.20: Mô tả sự tạo thành MOF từ ion cluster kim loại với cầu nối hữu cơ có góc liên kết khác nhau .30
Hình 2.21: Mô hình hóa cách tạo liên kết bên trong cấu trúc MOF-5 .31
Hình 2.22: Sự tạo thành cấu trúc ba chiều trong tinh thể MOF-5. .32 a) Cấu trúc MOF-5 được tạo thành từ cluster Zn4O liên kết với benzen1,4- dicarboxylat tạo thành khung mạng lập phương. 32 b) Cấu trúc MOF-5 được mô hình hóa dưới dạng cầu và que. 32
c) Cấu trúc MOF-5 được bao bọc cluster (OZn4)O12 với ion benzen1,4- dicarboxylat .32
Hình 2.23: Biểu diễn cấu trúc không gian tạo thành MOF-177. 33 a) Một phân tử 1,3,5-tribenzenbezoat liên kết với 3 cluster Zn4O. .33 b) Hình chiếu của cấu trúc MOF-177 xuống mặt [001]. 33 c) Một phần của cấu trúc từ một tâm của cluster Zn4O 33
Hình 2.24: Các IRMOF được mô hình hóa 35
Hình 2.25: Mô hình hóa khả năng hấp thụ CO2 của MOF-177 .36
Hình 2.26: Mô tả sự lưu trữ khí H2 của một số loại MOF .37
Hình 2.27: Sự lưu giữ khí CO2 ở nhiệt độ phòng với các loại MOF khác nhau 37
Hình 2.28: Phản ứng Benzoic aldehyde với Me3SiCN sử dụng xúc tác Cd(II) 4,4’- bipyridine ở 313K, 24 giờ, hiệu suất phản ứng 77% 38

Hình 2.29: Đường đẳng nhiệt của quá trình hấp/ giải hấp của ba vật liệu được nghiên cứu ở nhiệt độ phòng (phần bên dưới). Từ trái sang phải phần ở trên là cấu trúc của M-CPO-27 (M = Ni/Co), HKUST-1 và M-MIL-53 (M = Al/Cr). 39
Hình 3.1 : Sơ đồ mô tả các quá trình tổng hợp ligand AD .41
Hình 3.2 Quy trình hoạt hóa mẫu .44
Hình 4.1: Phổ NMR 1H của sản phẩm sau 12 giờ phản ứng tại 50oC 45
Hình 4.2: Phổ hồng ngoại của sản phẩm sau 3 giờ phản ứng tại 80oC 46
Hình 4.3: Phổ LC-MS của sản phẩm sau 3 giờ phản ứng tại 80oC .47
Hình 4.4: Phổ 1H-NMR của sản phẩm sau 3 giờ phản ứng tại 80oC 48
Hình 4.5: Phổ 13C-NMR của sản phẩm sau 3 giờ phản ứng tại 80oC .49
Hình 4.6: Công thức cấu tạo của axít azobenzen 4,4’-dicarboxylic a) dạng cis b)
dạng trans 50
Hình 4.7. Tinh thể tạo thành trong hỗn hợp AD (0,008 M)/Zn (0,002 M) trong dung môi DMF, nhiệt độ 85oC. 51
Hình 4.8: Tinh thể tạo thành từ AD (0,002 M) và Zn, tỉ lệ AD/Zn a) 1 : 4; b) 1: 2; c)
1 : 1; d) 2 : 1, trong dung môi DMF, thời gian 2 ngày, nhiệt độ 85oC 57
Hình 4.9: Tinh thể tạo thành từ AD và Zn (0,004 M), tỉ lệ (a) 1 : 3;(b )1 :1;(c)2 : 5; (d)1 : 4), trong dung môi DMF, thời gian 3 ngày, nhiệt độ 85oC 58
Hình 4.10: Tinh thể tạo thành từ ligand AD (0,006 M) và Zn ở tỉ lệ (a) 1:1; 59 (b) 3 : 1;(c) 2 : 1, (d) 3 : 4, trong dung môi DMF, thời gian 2 ngày, nhiệt độ 90oC .59
Hình 4.11: Tinh thể tạo thành từ AD và Zn (0,008 M), tỉ lệ (a) 1 : 1;(b) 3 : 1; .60 (c) 1 : 3, (d) 2 : 3, trong dung môi DMF, thời gian 1 ngày, nhiệt độ 95oC 60
Hình 4.12: Tinh thể tạo thành từ ligand AD (0,01 M) và Zn ở tỉ lệ (a) 1 : 3; .61 (b) 1 : 2; (c)1:1, (d) 3 :4, trong dung môi DMF, thời gian 1 ngày, nhiệt độ 90oC .61
Hình 4.13: Tinh thể MOF kết tinh trong DMF/DMSO = 5,5 : 0,5, với nồng độ AD :
0,01M, tỉ lệ AD/Zn = 1 : 1, sau 4 ngày dung môi nhiệt tại a) nhiệt độ 80oC, b) nhiệt độ 90oC 63


Hình 4.14: Ảnh tinh thể tổng hợp ở nhiệt 90oC, nồng độ AD 0,01 M, tỉ lệ AD / Zn =
1 : 1, sau 1 ngày, pH của dung dịch 4,22 (a), 4,32 (b), 4,54(c), 4,75 (d), 4,85(e), 5,20 (f). 64
Hình 4.15:Ảnh hiển vi của vật liệu được tổng hợp trong điều kiện tỉ lệ nồng độ AD
0,01 M, tỉ lệ AD/Zn = 1 : 1, thời gian ủ nhiệt 5 ngày tại 80oC,tương ứng với giá trị
pH của dung dịch là 4,4 (a), 4,68 (b), 4,86(c), 5,02 (d), 5,25(e) .65
Hình 4.16: Nhiễu xạ tia X của vật liệu trong trường hợp 1 67
Hình 4.17: Nhiễu xạ tia X của axít azobenzen 4,4’-dicarboxylic 67
Hình 4.18: Phổ nhiễu xạ tia X của vật liệu trong trường hợp 2 .68
Hình 4.19: Phổ nhiễu xạ tia X của vật liệu trong trường hợp 3 .69
Hình 4.20: Giản đồ phân tích nhiệt của vật liệu trong trường hợp 1 .70
Hình 4.21: Giản đồ phân tích nhiệt của vật liệu trong trường hợp 2 .71
Hình 4.22: Giản đồ phân tích nhiệt của vật liệu trong trường hợp 3 .72
Hình 4.23: Đường hấp phụ đẳng nhiệt a) mô hình BET, b) Langmuir của vật liệu trường hợp 1 73
Hình 4.24: Đường hấp phụ đẳng nhiệt của vật liệu tổng hợp theo trường hợp 2 theo mô hình BET (a), mô hình Langmuir (b) 74
Hình 4.25: Đường đẳng nhiệt hấp thụ của vật liệu ở trường hợp 3 75
Hình 4.26: Sự phân bố kích thước lỗ theo phương pháp DUBININ – ASTAKHOV (DA) 76
Hình 5.1: Mô hình hóa cấu trúc vật liệu về mặt lý thuyết bằng phần mềm crystal maker .77
Hình 5.2. Cấu trúc đơn tinh thể của vật liệu tổng hợp ở trường hợp 3 78




MỞ ĐẦU


Ngày nay công nghệ sinh học đang ngày càng phát triển, nó có vai trò quan trọng và phục vụ đắc lực để cải thiện chất lượng cuộc sống của con người. Lĩnh vực được quan tâm và đầu tư nhiều chất xám là y học - sinh học - thực phẩm nhằm tạo ra các sản phẩm có lợi cho sức khỏe con người, phòng tránh bệnh tật . Một trong những sản phẩm đó là Galacto-oligosaccharide (GOS), chất được biết có khả năng duy trì hệ tiêu hóa bình thường khỏe mạnh, đã và đang được nghiên cứu [17].
Trong công nghiệp chế biến phó-mát thì dịch sữa sau khi đông tụ là nguồn cơ chất giàu lactose, có thể nghiên cứu dùng làm cơ chất tổng hợp GOS. Tuy nhiên để tạo được GOS từ sữa thì cần phải có một enzym đặc hiệu. Ngày nay enzym beta- galactosidase được biết có khả năng thủy phân lactose thành glucose và galactose, đồng thời còn tạo ra các sản phẩm phụ là các GOS. Các GOS này không có giá trị dinh dưỡng với con người, không được cơ thể con người hấp thụ nhưng lại được vi khuẩn ở ruột già sử dụng, do đó các GOS này có tiềm năng để sản xuất prebiotic[18].

Trên thế giới GOS đã được nghiên cứu và sản xuất thương mại, GOS được thừa nhận và bổ sung vào thực phẩm ở châu Âu. Đã có nhiều chiến lược được đặt ra để sản xuất GOS dạng công nhiệp. Từ những năm 1950 người ta đã biết được rằng những oligosaccharide có thể được hình thành từ monosaccharide với xúc tác là các acid vô cơ. Aronso đầu tiên đã thu được oligosaccharide khi thủy phân lactose trong môi trường acid [3]. Do sản phẩm tạo ra thiếu sự đa dạng và ở điều kiện khắc nghiệt khi dùng acid thủy phân lactose, con đường sản xuất GOS này đã không được dùng trong công nghiệp. Một hướng khác để sản xuất GOS là sử dụng enzym glycosyl transferase hoặc glycoside hydrolase [15]. Dù hiệu quả nhưng glycosyl transferase không được dùng phổ biến trong sản xuất GOS do giá thương mại cao, mặt khác phân tử đường cho trong phản ứng phải chứa nucleoside phosphate hoặc lipid phosphate [13].
Hiện nay các glycoside hydrolase (GH) được sử dụng trong công nghiệp sản xuất GOS. Lactose được xem là cơ chất tự nhiên của các enzym có hoạt tính beta- galactosidase thuộc họ GH1 và GH2 [3]. Họ GH2 gồm hai loại beta-alacotosidase

từ vi khuẩn, enzym beta-galactosidase được mã hóa bởi gen LacZ từ E.coli là một trong hai loại đó [52].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng GOS thì chưa được rộng rãi trong công nghiệp do thiếu nguồn enzym beta-galactosidase, với mục đích nhằm sản xuất ra lượng lớn loại enzym beta-galactosidase có hoạt tính tạo GOS hiệu suất cao chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài này.
Về mặt khoa học, mục tiêu của đề tài nhằm nghiên cứu sản xuất beta- galactosidase tái tổ hợp có hoạt tính bao gồm: tạo dòng E.coli tái tổ hợp biểu hiện beta-galactosidase, lên men, xử lý tạo enzym có hoạt tính cao bằng nhiều phương pháp khác nhau. Ý nghĩa thực tiễn mang lại là ứng dụng công nghệ gen, công nghệ lên men và công nghệ protein để tạo ra một loại enzym có hoạt tính thủy phân và hiệu suất tạo GOS cao, ứng dụng trong lĩnh vực trị bệnh khó tiêu hóa lactose và làm nguyên liệu cho sản xuất prebiotic, bổ sung vào sữa cho trẻ.
Tuy nhiên do thời gian làm luận văn bị hạn chế, đề tài này chỉ tập trung nghiên cứu các vấn đề sau:
Tạo gen mã hóa beta-galactosidase bằng PCR với mồi đặc hiệu.
Tạo dòng gen mã hóa beta-galactosidase vào plasmid pTrcHisB trong E.coli DH5α.
Cấu trúc chủng E.coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ biểu hiện protein dung hợp với đuôi 6xHis ở dạng tan trong tế bào chất.
Thử khả năng thu hồi enzym 6xHis-betagalactosidase bằng hạt Ni-NTA.
Xác định hoạt tính enzym tái tổ hợp 6xHis-betagalactosidase thu được, xácđịnh pH, nhiệt độ tối ưu.
Thử khả năng sinh GOS của enzym tái tổ hợp 6xHis-betagalactosidase.