Thạc Sĩ Dòng hóa, biểu hiện và tinh sạch BETA - GALACTOSIDASE trong Escherichia coli

MỞ ĐẦU

Ngày nay công nghệ sinh học đang ngày càng phát triển, nó có vai trò quan trọng và phục vụ đắc lực để cải thiện chất lượng cuộc sống của con người. Lĩnh vực được quan tâm và đầu tư nhiều chất xám là y học - sinh học - thực phẩm nhằm tạo ra các sản phẩm có lợi cho sức khỏe con người, phòng tránh bệnh tật . Một trong những sản phẩm đó là Galacto-oligosaccharide (GOS), chất được biết có khả năng duy trì hệ tiêu hóa bình thường khỏe mạnh, đã và đang được nghiên cứu [17]. Trong công nghiệp chế biến phó-mát thì dịch sữa sau khi đông tụ là nguồn cơ chất giàu lactose, có thể nghiên cứu dùng làm cơ chất tổng hợp GOS. Tuy nhiên để tạo được GOS từ sữa thì cần phải có một enzym đặc hiệu. Ngày nay enzym beta-galactosidase được biết có khả năng thủy phân lactose thành glucose và galactose, đồng thời còn tạo ra các sản phẩm phụ là các GOS. Các GOS này không có giá trị dinh dưỡng với con người, không được cơ thể con người hấp thụ nhưng lại được vi khuẩn ở ruột già sử dụng, do đó các GOS này có tiềm năng để sản xuất prebiotic [18]. Trên thế giới GOS đã được nghiên cứu và sản xuất thương mại, GOS được thừa nhận và bổ sung vào thực phẩm ở châu Âu. Đã có nhiều chiến lược được đặt ra để sản xuất GOS dạng công nhiệp. Từ những năm 1950 người ta đã biết được rằng những oligosaccharide có thể được hình thành từ monosaccharide với xúc tác là các acid vô cơ. Aronso đầu tiên đã thu được oligosaccharide khi thủy phân lactose trong môi trường acid [3]. Do sản phẩm tạo ra thiếu sự đa dạng và ở điều kiện khắc nghiệt khi dùng acid thủy phân lactose, con đường sản xuất GOS này đã không được dùng trong công nghiệp. Một hướng khác để sản xuất GOS là sử dụng enzym glycosyl transferase hoặc glycoside hydrolase [15]. Dù hiệu quả nhưng glycosyl transferase không được dùng phổ biến trong sản xuất GOS do giá thương mại cao, mặt khác phân tử đường cho trong phản ứng phải chứa nucleoside phosphate hoặc lipid phosphate [13].
Hiện nay các glycoside hydrolase (GH) được sử dụng trong công nghiệp sản xuất GOS. Lactose được xem là cơ chất tự nhiên của các enzym có hoạt tính beta-galactosidase thuộc họ GH1 và GH2 [3]. Họ GH2 gồm hai loại beta-galacotosidase từ vi khuẩn, enzym beta-galactosidase được mã hóa bởi gen LacZ từ E.coli là một trong hai loại đó [52]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng GOS thì chưa được rộng rãi trong công nghiệp do thiếu nguồn enzym beta-galactosidase, với mục đích nhằm sản xuất ra lượng lớn loại enzym beta-galactosidase có hoạt tính tạo GOS hiệu suất cao chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài này. Về mặt khoa học, mục tiêu của đề tài nhằm nghiên cứu sản xuất beta-galactosidase tái tổ hợp có hoạt tính bao gồm: tạo dòng E.coli tái tổ hợp biểu hiện beta-galactosidase, lên men, xử lý tạo enzym có hoạt tính cao bằng nhiều phương pháp khác nhau. Ý nghĩa thực tiễn mang lại là ứng dụng công nghệ gen, công nghệ lên men và công nghệ protein để tạo ra một loại enzym có hoạt tính thủy phân và hiệu suất tạo GOS cao, ứng dụng trong lĩnh vực trị bệnh khó tiêu hóa lactose và làm nguyên liệu cho sản xuất prebiotic, bổ sung vào sữa cho trẻ. Tuy nhiên do thời gian làm luận văn bị hạn chế, đề tài này chỉ tập trung nghiên cứu các vấn đề sau: Tạo gen mã hóa beta-galactosidase bằng PCR với mồi đặc hiệu. Tạo dòng gen mã hóa beta-galactosidase vào plasmid pTrcHisB trong E.coli DH5α. Cấu trúc chủng E.coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ biểu hiện protein dung hợp với đuôi 6xHis ở dạng tan trong tế bào chất. Thử khả năng thu hồi enzym 6xHis-betagalactosidase bằng hạt Ni-NTA. Xác định hoạt tính enzym tái tổ hợp 6xHis-betagalactosidase thu được, xác định pH, nhiệt độ tối ưu. Thử khả năng sinh GOS của enzym tái tổ hợp 6xHis-betagalactosidase.

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT . v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH . vii DANH MỤC ĐỒ THỊ . 9
MỞ ĐẦU . 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Enzyme beta-galactosidase 5
1.1.1 Giới thiệu . 5 1.1.2. Cơ chế . 6
1.1.3. Cấu trúc beta-galactosidase nguồn gốc E.coli 7
1.1.4. Ứng dụng 7
1.1.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất beta-galactosidase trong và ngoài nước 7
1.2. Lactose . 8
1.3. Giới thiệu chung về Galacto-oligosaccharide (GOS) từ lactose 9
1.3.1. Cấu trúc GOS . 9
1.3.2. Cơ chế tổng hợp GOS 10 1.3.3. Đặc điểm GOS 11
1.3.4. Ứng dụng 13 1.4. Tế bào E.coli và sự biểu hiện protein tái tổ hợp 13
1.4.1. Đặc điểm E.coli 13 1.4.2. Các chủng E.coli dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp . 14
1.5. Một vài hệ thống vector biểu hiện protein . 15
1.5.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST . 15
1.5.2. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP-Hệ thống pMAL 15
1.5.3. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP 16
1.5.4. Hệ thống pTrcHis trong sản xuất protein tái tổ hợp dung hợp 6xHis 16
Chương 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu 18
2.1.1 Gen mã hóa beta-galactosidase . 18
2.1.2. Chủng vi sinh vật 18
2.1.3. Plasmid dùng trong thí nghiệm 19
2.1.4. Mồi khuếch đại gen LacZ . 21
2.1.5. Thang phân tử dùng trong điện di DNA/RNA . 21
2.2. Dụng cụ - thiết bị 22
2.2.1. Dụng cụ thiết bị thông dụng . 22
2.2.2. Thiết bị dùng trong sinh học phân tử . 22
2.2.3. Thiết bị dùng trong thao tác nuôi cấy vi sinh . 22
2.2.4 Thiết bị dùng cho tinh chế protein 23
2.3. Hóa chất và môi trường 23
2.3.1 Hóa chất . 23
2.3.2 Môi trường . 26
2.4. Phương pháp . 27
2.4.1. Thiết kế mồi chuyên biệt 27
2.4.2. Xác định gen LacZ trên ngân hàng gen 28
2.4.3. Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến . 29
2.4.4. Phương pháp tách chiết thu plasmid 29
2.4.5. Phương pháp điện di DNA . 30
2.4.5.1. Nguyên tắc 30
2.4.5.2. Phương pháp . 31
2.4.6. Tạo chủng E.coli Mach1 ™ -T1R mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ mã hóa beta-galactosidase 31
2.4.6.1. Thu nhận gen LacZ . 32
2.4.6.2. Thiết lập phản ứng nối gen LacZ vào plasmid pCR®-XL-TOPO® 36
2.4.6.3. Điện biến nạp plasmid pCR®-XL-TOPO®/LacZ vào tế bào E.coli Mach1™ -T1R khả biến. 36
2.4.7. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pCR®-XL-TOPO®/LacZ 37
2.4.7.1. Kiểm tra dòng mang Plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR. . 37
2.4.7.2. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pCR®-XL-TOPO®/LacZ bằng enzyme cắt giới hạn . 38
2.4.8. Tinh sạch thu băng LacZ trên gel agarose điện di với crystal violet 38
2.4.9. Tạo dòng đưa gen LacZ vào plasmid pTrcHisB . 39
2.4.9.1. Cắt tạo plasmid pTrcHisB đầu dính bằng hai enzyme XhoI và HindIII 39
2.4.9.2. Thực hiện phản ứng nối gen LacZ vào plasmid pTrcHisB . 40
2.4.9.3. Điện biến nạp chuyển plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ vào E.coli DH5α khả biến. . 40
2.4.9.4. Kiểm tra dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ . 41
2.4.10. Tạo dòng E.coli BL21(DE3) có khả năng biểu hiện beta-galactosidase hoạt tính. . 43
2.4.11. Điện di SDS-PAGE 43 2.4.11.1. Nguyên tắc 43
2.4.11.2. Phương pháp SDS-PAGE . 43
2.4.12. Cảm ứng biểu hiện và xác nhận sự biểu hiện của 6xHis- betagalactosidase . 44 2.4.12.1. Cảm ứng biểu hiện . 44
2.4.12.2. Kiểm tra sự biểu hiện của 6xHis-betagalactosidase bằng phương pháp SDS-PAGE . 45
2.4.12.3. Kiểm tra phân đoạn thu 6xHis- betagalactosidase 45
2.4.13. Thử khả năng thu hồi 6xHis- betagalactosidase với hạt Ni-NTA, dùng Imidazol ở tỷ lệ khác nhau . 47
2.4.14. Xác định nhiệt độ, pH tối ưu cho enzym 6x-betagalactosidase . 47
2.4.15. Thử khả năng sinh GOS từ enzym beta-galactosidase thu được bằng sắc ký lỏng HPLC. 48
Chương 3: Kết Quả - Biện Luận
3.1.Tạo dòng gen LacZ trong plasmid pCR-XL-TOPO® vào tế bào E.coli Match1TM-T1R khả biến. 50
3.1.1. Tổng hợp gen LacZ mã hóa beta-galactosidase . 50 3.1.2. Tạo dòng gen LacZ vào plasmid pCR-XL-TOPO®. . 51
3.2. Kiểm tra dòng E.coli Match1TM-T1R mang Plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ . . 53
3.2.1. Dùng phương pháp cắt hạn chế kiểm tra dòng E.coli Match1TM-T1R mang Plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ, thu gen LacZ 53
3.2.2. Giải trình tự so sánh trình gen LacZ thu được với gen LacZ trên plasmid pAc5.1/V5-HisB/LacZ. 54
3.3. Tạo dòng gen LacZ vào plasmid pTrcHisB trong tế bào E.coli DH5α . 61
3.4. Tạo dòng tế bào E.coli BL21(DE3) mang plasmid pTricHisB/LacZ, . 64
3.5. Kiểm tra khả năng biểu hiện enzyme beta-galactosidase hoạt tính dạng dung hợp 6xHis-betagalactosidase . 65
3.6. Định tính khả năng biểu hiện 6xHis-betagalactosidase có hoạt tính trong E.coli BL21(DE3). . 66
3.7. Xác định phân đoạn thu 6xHis-betagalactosidase trong E. coli BL21(DE3) 69
3.8. Thử khả năng thu hồi 6xHis-LacZ với hạt Ni-NTA, dùng Imidazol ở tỷ lệ khác nhau. 70
3.9. Xác định nhiệt độ, pH tối ưu của enzym 6xHis-betagalactosidase 71
3.9.1. xác định nhiệt độ tối ưu 71
3.9.2. Xác định pH tối ưu . 73 3.10. Thử khả năng sinh GOS, phát hiện sản phẩm bằng sắc ký lỏng HPLC 74
Chương 4: Kết Luận – Đề Nghị
4.1. Kết luận 77
4.2. Kiến nghị 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78
PHỤ LỤC 84